CINETICA DI RINATURAZIONE DEL DNA

Rinaturazione del DNA NUCLEAZIONE È un evento in due tempi CHIUSURA Dipende da: Concentrazione del DNA in soluzione Contenuto in GC (maggiore è il contenuto in GC, minore sarà il numero dei nucleotidi che devono riconoscersi perché avvenga la NUCLEAZIONE) 3. Sale (alte concentrazioni di sale favoriscono la RINATURAZIONE -> basse concentrazioni la DENATURAZIONE) Numero delle molecole SIMILI in soluzione La rinaturazione del DNA dipende anche dalla complessità del DNA che si deve rinaturare ! poly A poly T frammento di 1000 bp gli eventi validi sono 1:2 fago T4 (2x105bp) frammento di 1000 bp I frammenti sono 200000 : 1000 = 200 Gli eventi validi sono 1:400 RINATURAZIONE RAPIDA RINATURAZIONE MENO RAPIDA

Integrando si ottiene l’equazione del c0t Rinaturazione del DNA v = k [c]2 perché è una reazione BIMOLECOLARE v = velocità di rinaturazione c = concentrazione del DNA a SINGOLO FILAMENTO (espressa in moli di nucleotidi/litro) d c d t v = - - d c d t = k [c]2 d c c2 = - k d t t = tempo (espresso in secondi) c/c0 esprime la concentrazione del DNA a SINGOLO FILAMENTO (questo valore va da 1 quando c=c0 a 0, quando c=0 ) Integrando si ottiene l’equazione del c0t c/c0 = 1 1 + kc0t c0t(scala logaritmica) espresso in Moli x sec/litro c/c0 1 La diminuzione di questo valore è funzione della concentrazione iniziale e del tempo 1/2 c0t/2 al tempo t/2 -> c/c0 = 1/2 1/2 = 1 1 + kc0t -> c0t/2= 1/k (questo valore cambia con il tipo di DNA)

Equazione del C0t 1 1/2 = -> c0t/2= 1/k 1 + kc0t (questo valore cambia con il tipo di DNA) c0t(scala logaritmica) espresso in Moli x sec/litro c/c0 1 1/2 c0t/2

DNA con complessità differenti hanno c0t differenti c/c0 1 1/2 flesso (cot/2) poly AT fago MS2 fago T4 E. coli 8 10 0,001 0,01 0,1 fago MS2 = 4 X 103 bp fago T4 = 2 X 105 bp E. coli = 8 X 166 bp c0t/2 coppie di basi 8 X 106 105 104 103 0,01 0,1 1 10 8 C’è una relazione LINEARE tra le coppie di basi che costituiscono un DNA ed il relativo cot (almeno per DNA di composizione “semplice”)

Curva del c0t di un DNA con composizione “mista” fago T4 = 2 X 105 bp E. coli = 8 X 166 bp E. coli c/c0 fago T4 1 1/2 0,1 1 8 10 C0t/2 Se si usa metà DNA del fago T4 e metà DNA di E.coli si ottiene una curva con caratteristiche miste tra le due curve specifiche Negli organismi superiori si ottengono curve miste

Curva del c0t del DNA di un organismo SUPERIORE c/c0 1 Curva del c0t del DNA di un organismo SUPERIORE c/c0 1 Ci sono 3 componenti: sequenze che rinaturano velocemente e corrispondono a sequenze ALTAMENTE RIPETUTE Sequenze che rinaturano ad un tempo intermedio e corrispondono a sequenze MEDIAMENTE RIPETUTE Sequenze che rinaturano lentamente e corrispondono a SEQUENZE UNICHE

Analisi del DNA di Drosophila mediante gradiente di densità O.D. 260 nm frazioni 1,705 1,702 1,689 1,672 questa frazione rappresenta l’8% del genoma I 3 picchi minori rappresentano quello che si chiama DNA satellite Il c0t della frazione con densità 1,689 è di circa 0,01 che corrisponde ad un DNA con una complessità di 4 x 103 bp Il genoma di Drosophila è di 1,5 x 108 bp l’ 8% è pari a circa 12 x 106 bp Quante volte è ripetuta questa sequenza nel genoma di Drosophila? 12 x 106 bp 4 x 103 bp = 3 x 103 Di che tipo di sequenze si tratta? Dove sono localizzate queste sequenze?

Costituzione e localizzazione del DNA satellite di Drosophila O.D. 260 nm frazioni 1,705 1,702 1,689 1,672 (IV) DNA principale (II+III) (I) La CINETICA DI RINATURAZIONE del DNA satellite corrisponde a quella di un elemento ripetuto migliaia di volte nel genoma Le ibridazioni in situ di queste sequenze ripetute dimostrano che sono localizzate nell’ ETEROCROMATINA Drosophila melanogaster Satellite % del genoma unità ripetitiva I 2 5’ [AATAT]AATATAATAT ecc. 1 5’ [AATATAT]AATATATAAT ecc. II 3 5’ [AATAACATAG]AATAAC ecc. III 5 unità ripetitive di 254 e di 359 bp IV 4 5’ [AAGAG]AAGAGAA ecc. 0,5 5’ [AAGAGAG]AAGAGAG ecc.

Le regioni colorate in arancione corrispondono all’ETEROCROMATINA telomeri Le regioni colorate in arancione corrispondono all’ETEROCROMATINA centromero eucromatina Alcune regioni del cromosoma restano condensate anche durante l’INTERFASE e si colorano intensamente ETEROCROMATINA

DNA satellite del topo OD a 260 nm Assorbanza satellite del TOPO 1,7 densità 1,7 1,69 satellite del TOPO

DNA satellite di topo ibridato su cromosomi mitotici Metafase di TOPO Prove che il DNA satellite corrisponde all’ETEROCROMATINA: la cinetica di rinaturazione dell’eterocromatina corrisponde a quella di DNA altamente ripetuto la costituzione del DNA satellite è di corte sequenze ripetute Se si ibrida il DNA satellite sui cromosomi la sua localizzazione è nell’ETEROCROMATINA

Colorazione (bande C) specifiche per regioni centromeriche Le bande C colorano regioni eterocromatiche

Cariotipo umano (bande C)

Centromeri di CROMOSOMI METAFASICI Cromosomi metafasici colorati mediante “ibridazione in situ fluorescente” (FISH) con una sonda che identifica in maniera specifica il CENTROMERO

FISH con sonde specifiche per i telomeri (sequenze ripetute)

Definizione di eterocromatina e le sue principali caratteristiche È una regione cromosomica che non mostra cambi di condensazione durante il ciclo cellulare È localizzata soprattutto ai telomeri ed ai centromeri Si REPLICA TARDIVAMENTE nel corso del ciclo cellulare rispetto all’eucromatina E’ ricca di sequenze ALTAMENTE E MEDIAMENTE RIPETUTE Mostra un BASSO GRADO DI RICOMBINAZIONE Mostra PLASTICITÀ: in alcuni organismi viene eliminata nelle cellule somatiche Le funzioni eterocromatiche sono più estese delle eucromatiche Induce VARIEGAZIONE PER EFFETTO DI POSIZIONE : geni eucromatici che per riarrangiamenti si posizionano vicino all’eterocromatina sono soggette a repressione “ a mosaico” (PEV)

Ruolo biologico dell’eterocromatina Entra nell’ appaiamento dei cromatidi fratelli Permette il riconoscimento dei cromosomi omologhi Organizza l’ architettura nucleare Ha un ruolo nella regolazione genica Nell’eterocromatina sono stati identificati una trentina di geni “normali” con esoni piccoli ed introni piuttosto lunghi, che contengono DNA satellite ed elementi ripetuti. La loro regolazione è strettamente dipendente dalla natura eterocromatica delle regioni in cui sono localizzati L’eterocromatina, inoltre, ha delle funzioni “criptiche” che sono state rivelate solo grazie alle interazioni con loci eucromatici. Si tratta di regioni contenenti RNA non codificanti (small e long non coding RNA) con ruoli importanti regolatori su geni specifici e sequenze ripetute.

Cariotipo di Drosophila melanogaster 2 3 4 X Y 4 2 3 X X

Eterocromatina del II cromosoma di Drosophila melanogaster 46 45 44 43 42 41 40 39 38 37 36 35 Regione pericentromerica

Mappa citologica dell’eterocromatina di Drosophila melanogaster Y X 2 3 4 C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 35 36 37 383940414243 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 61 60 59 rDNA kl5 kl3 kl2 kl1 cry ks1 ks2 Ste het E(SD) lt rl cta Rsp ABO Elementi trasponibili nell’ eterocromatina di Drosophila (mediamente ripetitivo) Doc Blood I + F+ G copia gypsy mdg1+mdg4 Bari 1 aurora DNA satellite : (altamente ripetitivo) AAGAG; AAGAC; AATAT; AATAC; AATAG; AAGAGAG; AATAGAC; AATAAAC; AATAACATAG

Varie classi di elementi ripetuti nel genoma umano (50%) da Treangen and Salzberg 2012

Cromosomi delle cellule germinali di Parascaris univalens N=2 eterocromatina eterocromatina I cromosomi delle cellule SOMATICHE (già dalle prime divisioni embrionali) PERDONO l’eterocromatina e restano unicamente EUCROMATICI -> l’eterocromatina ha una funzione importante nelle cellule germinali!!