Deve essere capace di REPLICAZIONE AUTONOMA Che caratteristiche deve presentare una molecola di DNA per poter essere definita cromosoma? Deve essere capace di REPLICAZIONE AUTONOMA Deve segregare (CENTROMERO) Mantenere la sua lunghezza (TELOMERO)

Classificazione dei cromosomi eucariotici basata sulla posizione del CENTROMERO Il centromero è la regione del cromosoma a cui si attaccano le fibre del fuso mitotico e meiotico Appare come un restringimento del cromosoma La posizione del centromero costituisce una caratteristica distintiva dei cromosomi METACENTRICO SUB-METACENTRICO ACROCENTRICO TELOCENTRICO Esistono dei cromosomi con un “centromero diffuso” (OLOCENTRICO) e le fibre del fuso si attaccano su tutta la lunghezza del cromosoma (Es. Caenorhabditis elegans)

(Caenorhabditis elegans) Il centromero è localizzato in una specifica regione del cromosoma......... ma può essere anche DIFFUSO Esistono dei cromosomi con un “centromero diffuso” (OLOCENTRICO) e le fibre del fuso si attaccano su tutta la lunghezza del cromosoma (Caenorhabditis elegans) Chromosomal attachment

Struttura e funzione del CENTROMERO Cromatidi fratelli Regione centromerica Il centromero è il responsabile della corretta segregazione dei cromosomi durante la divisione cellulare È la regione del cromosoma a cui le strutture del fuso mitotico o meiotico si attaccano È la regione di appaiamento dei cromatidi fratelli fino alla separazione A livello del centromero c’è un grado diverso di impaccamento della CROMATINA (fibre di 250 nm) Recentemente si è anche dimostrato che gli istoni dei centromeri sono diversi dagli istoni del resto della cromatina. Nei nucleosomi del centromero è presente una variante dell’istone H3 (CenH3o CENP-A). Il loop 1 e l’elica 2 di questo istone sono necessarie e sufficienti per dare la “specificità centromerica” a questo istone. A livello del centromero la fibra del DNA è suddivisa in 3 domini strutturali e funzionali CINETOCORE (esterno) DOMINIO CENTRALE APPAIAMENTO (interno)

Struttura del centromero 3 DOMINI CINETOCORE (esterno) : è un COMPLESSO multiproteico costituito da proteine complessate con DNA centromerico; non sono state identificate SEQUENZE SPECIFICHE DOMINIO CENTRALE : è costituito da DNA che presenta SEQUENZE SPECIFICHE RIPETUTE; nell’uomo c’è il “ DNA alfoide”, costituito da ripetizioni di 171 bp ripetute in tandem DOMINIO DI APPAIAMENTO : è la regione di interazione tra cromatidi fratelli di (interno) cromosomi metafasici; è un sito di legame per PROTEINE

Organizzazione delle sequenze “alfoidi” nei centromeri umani L’organizzazione delle ripetizioni nell’ ”high order repeat” è: testa-coda-testa ecc. Le sequenze delle singole ripetizioni possono variare una dall’altra anche fino al 40%. La funzione centromerica sembra associata all’organizzazione delle ripetizioni più che alle sequenze presenti nelle ripetizioni.

Struttura del centromero 3 DOMINI CINETOCORE (esterno) : è un COMPLESSO multiproteico costituito da proteine complessate con DNA centromerico; non sono state identificate SEQUENZE SPECIFICHE DOMINIO CENTRALE : è costituito da DNA che presenta SEQUENZE SPECIFICHE RIPETUTE; nell’uomo c’è il “ DNA alfoide”, costituito da ripetizioni di 171 bp ripetute in tandem DOMINIO DI APPAIAMENTO : è la regione di interazione tra cromatidi fratelli di (interno) cromosomi metafasici; è un sito di legame per PROTEINE

(cambia a seconda dell’organismo) ->CD4 Relazioni tra CENTROMERO e FIBRE DEL FUSO Fibra del microtubulo del fuso Centromero Elementi conservati nel DOMINIO CENTRALE NUCLEOSOMI 110 nucleotidi CD1 CD2 CD3 In aggiunta a questi elementi c’è una sequenza variabile di circa 100-130 nucleotidi (cambia a seconda dell’organismo) ->CD4

Struttura del CENTROMERO nel lievito 78-86 bp (90% AT) Sequenza variabile (100-135 bp) DOMINIO CENTRALE o “core” del centromero (220 bp, 15-20 nm) Nucleosoma (160 bp, 11 nm) FIBRA DEL FUSO (20 nm) Le regioni I e III sono molto conservate Le regioni I e II sono MENO CRITICHE per la FUNZIONE CENTROMERICA

Struttura del CENTROMERO in Drosophila melanogaster

Struttura del CENTROMERO in Caenorhabditis elegans

Centromeri di CROMOSOMI METAFASICI Cromosomi metafasici umani colorati mediante “ibridazione in situ fluorescente” (FISH) con una sonda che identifica in maniera specifica il CENTROMERO (DNA alfoide)

“Perdita” di centromeri nel corso dell’evoluzione Cariotipo dell’uomo -> 46 cromosomi (23 coppie) Cariotipo delle grandi scimmie antropomorfe -> 48 cromosomi (24 coppie) Il cromosoma 2 umano è derivato dalla fusione di due cromosomi delle grandi scimmie Cromosoma2 HSA (homo sapiens) Cromosomi ancestrali che si sono fusi di scimpanze, gorilla e orango

Deve essere capace di REPLICAZIONE AUTONOMA Che caratteristiche deve presentare una molecola di DNA per poter essere definita cromosoma? Deve essere capace di REPLICAZIONE AUTONOMA Deve segregare (CENTROMERO) Mantenere la sua lunghezza (TELOMERO)

TELOMERI I telomeri svolgono 2 funzioni fondamentali : Ciascuna estremità cromosomica è composta da una particolare struttura costituita da DNA e proteine TELOMERO è essenziale per la STABILITA’ del CROMOSOMA Ci sono state delle osservazioni genetiche (Muller) che hanno permesso di predire la presenza di una struttura con le caratteristiche di un telomero Muller verificò che, se i cromosomi venivano rotti mediante l’uso di raggi X, questi non si ritrovavano come cromosomi rotti, separati gli uni dagli altri, ma tendevano a formare strutture strane dovute a fusione tra i cromosomi rotti! (si era persa l’identità delle estremità dei cromosomi) I telomeri svolgono 2 funzioni fondamentali : Mantengono la lunghezza del cromosoma, in quanto la replicazione del DNA non riesce a coprire le estremità complete dei cromosomi 2) “CAPPING” proteggono la parte terminale del cromosoma affinchè non venga riconosciuta come rottura del cromosoma che porterebbe a MORTE CELLULARE PROGRAMMATA

Ibridazione in situ su cromosomi metafasici con una sonda specifica dei telomeri

Replicazione semiconservativa del DNA DNA parentale DNA dopo la prima replicazione DNA dopo la seconda

Meccanismo della REPLICAZIONE SEMICONSERVATIVA DEL DNA La replicazione del DNA inizia in un punto chiamato ORIGINE DI REPLICAZIONE La zona di attiva sintesi del DNA si chiama FORCA DI REPLICAZIONE La sintesi procede su CIASCUN FILAMENTO in direzione 5’->3’ Al termine della replicazione si ottengono due doppie eliche figlie ciascuna delle quali è formata da un filamento parentale ed uno di nuova sintesi

Singola FORCA DI REPLICAZIONE Filamenti stampo Forca di replicazione DNA polimerasi Frammenti di Okazaki Filamento guida Filamento ritardato

5’ 3’ Descrizione dettagliata di come avviene la sintesi del DNA a livello di ogni SINGOLA FORCA DI REPLICAZIONE A livello di ciascuna FORCA il “filamento guida” (leading) è sintetizzato in modo continuo visto che la direzione di sintesi della DNA polimerasi è 5’->3’ Il “filamento ritardato” (lagging) deve essere sintetizzato a pezzi, mano a mano che la forca di replicazione si apre L’inizio della sintesi per ciascun filamento necessita di un primer ad RNA Il “filamento ritardato” viene quindi sintetizzato come PEZZI separati (frammenti di OKAZAKI) che in seguito vengono uniti dalla ligasi dopo che il primer di RNA è stato degradato All’ultimo frammento di OKAZAKI che viene sintetizzato, in corrispondenza dell’estremità del cromosoma e quindi al telomero, il primer dell’RNA viene rimosso, ma il pezzo non viene sostituito dal corrispondente DNA, quindi ad ogni ciclo di replicazione l’estremità del DNA che corrisponde all’estremità del cromosoma diventa più corta

ACCORCIAMENTO DEI TELOMERI Le modalità con cui avviene la replicazione del DNA generano un processo di ACCORCIAMENTO dei telomeri ad ogni duplicazione; ciò porterebbe ad un punto critico in cui verrebbe bloccata la REPLICAZIONE del DNA e la cellula andrebbe incontro a MORTE CELLULARE PROGRAMMATA (apoptosi) La cellula è in grado di sopperire a questo “ACCORCIAMENTO” mediante la presenza di enzimi chiamati TELOMERASI che aggiungono piccole sequenze ripetute alle estremità del cromosoma La TELOMERASI è un complesso ribonucleoproteico, costituito da una componente ad RNA (che funge da stampo) e che funziona nell'insieme come una trascrittasi inversa (DNA polimerasi RNA dipendente). L’addizione di ripetizioni mediante la sintesi ex novo contrasta la perdita di ripetizioni, derivante dall’arresto della replicazione prima che sia raggiunta l’estremita’ del cromosoma. L’estensione e l’accorciamento sarebbero, quindi, in equilibrio dinamico

Le telomerasi I cromosomi eucariotici hanno estremità libere Le DNA polimerasi lavorano in maniera discontinua sul “filamento ritardato” e, all’ estremità del cromosoma, lasciano una piccola porzione non replicata Questo DNA telomerico che si perde ad ogni ciclo cellulare, non contiene sequenze codificanti ma sequenze ripetute Il DNA telomerico può essere allungato dalla Telomerasi, particolare DNA polimerasi attiva nelle cellule in intensa replicazione (cellule germinali e neoplastiche) La perdita di DNA telomerico sembra correlata al processo della senescenza e la possibilità di interferire farmacologicamente con le telomerasi apre prospettive nella terapia di malattie degenerative

Telomeri dei Mammiferi Nei Mammiferi i terminali dei cromosomi sono corte sequenze ripetute in tandem Nell’uomo ad esempio sono -> 5’TTAGGG 3’; in Arabidopsis thaliana 5’ TTTAGGG 3’ Molti eucarioti hanno la stessa situazione: ad esempio Tetrahymena 5’TTGGGG 3’ Molte specie estendono queste sequenze con enzimi specifici : TELOMERASI (DNA polimerasi RNA dipendente o trascrittasi inversa) Le sequenze TTGGGG o AACCCC e gli altri tipi di sequenze telomeriche diventano più corte ad ogni REPLICAZIONE DNA cromosomico Sintesi del filamento complementare del DNA La TELOMERASI allunga lo stampo del DNA al 3’ TELOMERASI di Tetrahymena Stampo di RNA interno alla telomerasi

Struttura dei telomeri La costruzione dei telomeri segue un principio universale: Ogni telomero consiste in una lunga serie di brevi sequenze ripetute in tandem (DNA satellite). Tutte queste sequenze possono essere scritte nella forma generale Cn(A/T)m, dove n è >1 e m varia da 1 a 4. TELOMERO UNITA’ RIPETUTA Macronucleo dei Ciliati (Tetrahymena) CCCCAA Macronucleo dei Ciliati (Oxytricha) CCCCAAAA Minicromosoma del Trypanosoma CCCTA Cromosoma di Arabidopsis thaliana CCCTAAA Crosomoma umano CCCTAA

“CAPPING” telomerico o protezione delle estremità libere La presenza di estremita’ libere a livello di ogni cromosoma puo’ dare luogo ad uno dei seguenti problemi: 1) Le estremità generate da rotture cromosomiche sono “appiccicose” e tendono a reagire con altri cromosomi dando luogo a “FUSIONI TELOMERICHE” 2) Le estremita’ libere possono essere riconosciute dalle nucleasi e quindi determinare degradazione del cromosoma Il telomero deve, quindi, “chiudere” ciascuna estremità del cromosoma

Sequenze telomeriche semplici all’estremità dei cromosomi di Tetrahymena D-loop t-loop Modello di struttura del telomero in cui il DNA telomerico si avvolge a formare un’ansa (t-loop o loop telomerica). L’estremità a singolo filamento si insinua tra le sequenze telomeriche a doppio filamento formando un D-loop o “Displacement loop”

Struttura a t-loop anche nei Mammiferi E' stato verificato, in vitro ed in vivo, che anche i telomeri di Mammifero assumono una conformazione chiamata t-loop Per tale struttura sono necessarie almeno 2 proteine: TRF1 e TRF2 (TTAGGG-Repeat Factor). Quest'ultima sembra permettere e stabilizzare l'inserimento del 3' overhang all'interno del doppio filamento di DNA telomerico Questa struttura del telomero consente di MASCHERARE il 3’ overhang dal riconoscimento del sistema di riparo del DNA e da possibili nucleasi

Fenotipo cromosomico di mutanti del gene “verrocchio” che codifica una proteina che si localizza ai telomeri e serve per la protezione telomerica. Colocalizza con HOAP e Moi a formare il capping telomerico da Raffa et al. 2010

Fenotipo cromosomico di mutanti del gene “modigliani” (MOI) che codifica una proteina che si localizza ai telomeri e serve per la protezione telomerica. Colocalizza con HOAP e Verrocchio a formare il “capping” telomerico da Raffa et al. 2009