all’ingegneria genetica Dalle biotecnologie all’ingegneria genetica CAPITOLO 9 Indice 1. Le biotecnologie: ieri e oggi 2. La tecnologia del DNA ricombinante 3. Produzione di proteine 4. Identificazione di un gene di DNA 5. La reazione a catena della polimerasi: la PCR 6. Sequenziamento del DNA (secondo Sanger) 7. Libreria genomica e libreria a cDNA 8. Analisi dell’espressione genica con microarray 9. Genomica e Proteomica 10. Gli anticorpi monoclonali 11. Gli RNA 12. Tecnologia delle cellule staminali 13. Clonazione 14. Terapia genica 15. Vaccini e anticorpi 16. Animali transgenici 17. Gli OGM: piante transgeniche 18. Le biotecnologie e le loro applicazioni 19. Biotecnologie ambientali

Le biotecnologie: ieri e oggi 1 Le biotecnologie: ieri e oggi Per biotecnonologie s’intendono tutte quelle tecniche che utilizzano cellule vive per ottenere prodotti utili all’uomo. Per migliaia di anni si è fatto il pane, il vino, la birra, tutti processi biotecnologici, senza sapere nulla della genetica, della biochimica e della fisiologia. A metà del Novecento, si ha lo sviluppo dell’ingegneria genetica: consiste di un insieme di tecniche, derivate dalla biologia molecolare, che permettono di manipolare il genoma di un organismo vivo e di trasferirlo da una specie ad un’altra.

Le biotecnologie: ieri e oggi 1 Le biotecnologie: ieri e oggi Si possono creare nuove specie, correggere i difetti genetici, produrre numerosi composti. L’ingegneria genetica permette di selezionare un gene e di trasferirlo nel DNA di una varietà commerciale. Gli organismi che hanno subito modificazioni mediante l’ingegneria genetica prendono il nome di organismi transgenici.

La tecnologia del DNA ricombinante 2 La tecnologia del DNA ricombinante Con la tecnologia del DNA ricombinante è possibile ottenere molte copie di un gene. Per operare con questa tecnica si devono seguire questi passaggi: a. Isolare il gene da cellule umane; b. Estrarre il plasmide dai batteri (escherichia coli). Per estrarre il gene umano il DNA viene tagliato con gli enzimi di restrizione (forbici molecolari). Questi stessi enzimi devono essere utilizzati per tagliare il plasmide in un solo punto. Il DNA umano e il plasmide devono essere tagliati con gli stessi enzimi da restrizione in modo che le loro estremità siamo complementari. L’unione del gene umano con il plasmide si realizza mediante un enzima chiamato DNA-ligasi. Il risultato è una molecola di DNA ricombinante che, una volta introdotto nel batterio, si moltiplicherà producendo molte copie del DNA ricombinante (clonazione del DNA).

Produzione di proteine 3 Produzione di proteine Uno degli esempi più noti delle tecnica del DNA ricombinante è la produzione dell’insulina. Con la tecnica del DNA ricombinante vengono prodotte, oltre all’insulina, numerose altre sostanze: − l’ormone della crescita; − il fattore VIII della coagulazione; − l’interferone; − i vaccini.

Identificazione di un gene di DNA 4 Identificazione di un gene di DNA Il DNA genomico, dopo che è stato estratto da una cellula, viene trattato con un conveniente enzima di restrizione. I frammenti che si ottengono sono separati mediante elettroforesi su agarosio. Per individuare nel gel la banda di DNA che presenta il gene da clonare, nel 1975 Edward Southern suggerì una tecnica, chiamata Southern Blotting (blotting in inglese significa assorbimento) dal nome del suo scopritore. I frammenti di DNA, separati con l’elettroforesi vengono ricoperti da carta assorbente e da una membrana. I frammenti vengono assorbiti dalla carta e trasferiti alla membrana. Solo allora vengono esposti ad una sonda di DNA fluorescente e mediante ibridazione essere individuati.

La reazione a catena della polimerasi: la PCR 5 La reazione a catena della polimerasi: la PCR Per ottenere molte copie di un gene la tecnica del clonaggio del DNA implica l’inserimento del gene in cellule viventi batteriche che, a loro volta, replicano il gene con il proprio DNA durante le fasi di divisione e di replicazione. Il processo della PCR, sviluppato dal chimico Kary Mullis nel 1985, invece, si svolge in una singola provetta mescolando semplicemente DNA con una serie di reagenti e ponendo la provetta in un termociclatore (foto a destra). Questo apparecchio, mediante una serie ripetuta di riscaldamento e di raffreddamento, permette di ottenere in poche ore, anche con una piccola quantità di DNA iniziale, milioni di copie di un gene. Applicazioni della PCR La reazione a catena della polimerasi ha molte aree di applicazione in chimica, genetica e biologia. Questa tecnica trova anche applicazioni in criminologia perché permette di rivelare o identificare frammenti di DNA che possono individuare uno specifico individuo.

Sequenziamento del DNA (secondo Sanger) 6 Sequenziamento del DNA (secondo Sanger) Frederick Sanger e collaboratori svilupparono un metodo detto metodo dei terminatori di catena (chain terminator method), o metodo di Sanger, che gli valse il secondo premio Nobel. Questa tecnica permette di sequenziare il DNA, cioè di determinare l’esatta sequenza dalle basi in un frammento di DNA a singolo filamento. Per leggere il gene, per prima cosa il genetista deve copiarlo. Per tale scopo procede allo stesso modo della replicazione del DNA. Il metodo Sanger richiede i seguenti componenti: − Copie del gene a singolo filamento da leggere. − Primers di DNA (oligonucleotidi a singolo filamento di 20-30 basi) marcati con sostanza fluorescente. − Una elevata quantità dei quattro componenti del DNA, i deossiribonucleotiditrifosfato: A, T, G, C (dNTP). − La Taq DNA polimerasi, l’enzima che sintetizza DNA. − Quattro nucleotidi modificati (di-deossiribonucleotiditrifosfato), chiamati terminatori e indicati con ddNTP, nei quali sul carbonio 3’ del ribosio vi è la presenza di un H al posto di OH. A causa di questa sostituzione, la reazione di polimerizzazione che porta alla sintesi della catena viene bloccata.

Libreria genomica e libreria a cDNA 7 Libreria genomica e libreria a cDNA Una libreria genomica è un insieme di cloni che contiene una copia di ogni singolo gene presente nel DNA di un particolare organismo. Una libreria genomica è una collezione di cloni che rappresentano l’intero genoma di un organismo. L’identificazione del clone contenente il gene a cui si è interessati si esegue mediante sonde. Una libreria a cDNA, invece, contiene solo i geni espressi in una cellula.

Analisi dell’espressione genica con microarray 8 Analisi dell’espressione genica con microarray La tecnologia dei microarray a DNA, noti anche come DNA chip, permette l’analisi dell’espressione dei geni di un genoma (trascrittoma) e, quindi, lo studio sistematico dell’espressione genica di un tessuto o di un organismo. La biologia molecolare tradizionale analizzava un gene alla volta, mentre la tecnologia dei microarray analizza contemporaneamente l’attività di migliaia di geni. In particolare consente di studiare i cDNA di una cellula, cioè quali geni di cellula sono espressi. In questo chip a DNA sono contenute le sonde che permettono di analizzare l’espressione dei geni di un genoma.

9 Genomica e Proteomica La genomica è la conoscenza completa del genoma e le interazioni che legano i geni che lo compongono. L’insieme delle proteine prodotte dal genoma prende il nome di proteoma. La proteomica è la disciplina che studia l’insieme completo di proteine codificate dal genoma di un organismo. Ad organismi geneticamente identici, ma con diverso proteoma, corrispondono fenotipi differenti. Girino e rana derivano dallo stesso genoma ma mostrano fenotipi diversi, cioè caratteri morfologici differenti.

Gli anticorpi monoclonali 10 Gli anticorpi monoclonali Quando sostanze estranee, batteri, virus, funghi, entrano nel nostro organismo, i globuli bianchi (linfociti) del nostro sistema immunitario si attivano creando “anticorpi” che colpiscono queste sostanze estranee (antigeni). I linfociti B del nostro organismo riescono a neutralizzare l’agente patogeno perché sulla superficie dell’antigene è presente una struttura che lo caratterizza. Un sistema vivente, sotto lo stimolo di un antigene, dà luogo ad una miscela eterogenea di anticorpi. Questi sono prodotti da differenti tipi di cellule immunitarie (linfociti B), per cui sono noti come anticorpi policlonali. Per utilizzare un singolo anticorpo contro il suo antigene specifico sono stati creati anticorpi monoclonali, cioè anticorpi altamente specifici, che possono attaccare un solo particolare antigene.

11 Gli RNA Il concetto chiave della biologia molecolare ammette che per la traduzione dei geni è necessaria la presenza di un intermediario, l’acido ribonucleico (RNA). L’RNA presenta una struttura simile al DNA ma, come sappiamo, è formato da un solo filamento. È l’RNA messaggero (mRNA) che si traduce in proteine. La tecnologia antisenso Con la terapia antisenso si introduce nella cellula un filamento di RNA complementare a quello dell’mRNA che produce la proteina responsabile di una malattia. In seguito all’accoppiamento dei due filamenti, l’mRNA non può legarsi al ribosoma e, quindi, la proteina non viene prodotta. RNA interfering L’RNA interfering (RNAi) si presenta molto simile all’interferenza antisenso, anche se offre un potenziale terapeutico molto più promettente. Con questa tecnica non si verifica la traduzione del gene che determina il quadro clinico negativo perché viene silenziata l’espressione del gene. La siRNA produce la distruzione degli mRNA prima che possano convertirsi in una proteina.

Tecnologia delle cellule staminali 12 Tecnologia delle cellule staminali Le cellule staminali sono cellule che hanno la capacità di dividersi e, rispetto ad altri tipi di cellule, possono specializzarsi. Esistono due tipi di cellule staminali: le adulte e le embrionali. Il corpo di ogni essere umano è costituito da cellule staminali adulte (AS). Queste possono differenziarsi in diversi tipi cellulari di una stessa classe di cellule. Quando una cellula staminale AS, che è solo parzialmente differenziata, riceve l’ordine di dividersi in due cellule, una di esse si mantiene staminale mentre l’altra diventa una cellula normale che si specializza in un particolare tessuto. Le cellule staminali embrionali (ES) non sono specializzate. Esse possono con la divisione cellulare differenziarsi in tutti i tipi di cellule specializzate presenti nel nostro corpo: muscolari, nervose, ossee, epiteliali.

13 Clonazione Con il metodo della clonazione viene creata una copia, geneticamente identica, di un animale o di una pianta. Nel 1997, gli esperimenti condotti da Ian Wilmut e dai suoi collaboratori, presso il Roslin Institute, in Scozia, portarono alla nascita di un clone, mediante la tecnica del trasferimento nucleare, una pecora chiamata Dolly.

14 Terapia genica La ricerca di base della medicina genetica si è posta tra i suoi obiettivi quella di trovare la cura per le malattie che presentano alterazioni nei geni. La terapia genica è applicabile solo alle malattie che dipendono da un unico gene. Con la terapia genetica un gene sano viene integrato nel DNA della cellula inferma. La terapia genica può creare danni. Per esempio, il virus che deve introdurre il gene intatto nel genoma difettoso può indurre una reazione immunitaria che, in qualche caso, è causa di morte del paziente. Presenta anche altri inconvenienti: in certe condizioni, si può avere inattivazione di un gene funzionale e anche lo sviluppo di un cancro. Ciò è dovuto al fatto che il gene introdotto si lega in una posizione aleatoria. Per questi motivi la terapia genica incontra qualche resistenza nell’applicazione clinica.

15 Vaccini e anticorpi In medicina viene ricordato che è “meglio prevenire che curare”. Questo è particolarmente valido per presidi terapeutici come le vaccinazioni. Queste, infatti, ci proteggono da malattie gravi, potenzialmente anche mortali, e costituiscono uno dei più efficaci mezzi di prevenzione a disposizione della sanità pubblica. Cosa contengono e come funzionano i vaccini La vaccinazione può essere di due tipi: passiva e attiva. Nella vaccinazione passiva si iniettano anticorpi che circolano nell’organismo per un tempo definito (settimane o mesi), cioè il tempo necessario per proteggere la persona vaccinata. In questa vaccinazione non si formano cellule memoria che possano reagire immediatamente ad una infezione dopo anni. È quindi una vaccinazione di emergenza, ad esempio, quella influenzale.

15 Vaccini e anticorpi Nella vaccinazione attiva si iniettano nell’organismo agenti patogeni vivi ma indeboliti (attenuati) oppure frammenti di agenti patogeni (antigeni) manipolati in laboratorio con l’ingegneria genetica. Esempi di vaccini attenuati sono il Sabin contro la poliomielite e il vaccino contro il morbillo, la pertosse e la rosolia. Virus della poliomielite osservato al microscopio elettronico. Con la vaccinazione attiva si ha produzione di anticorpi specifici e, nello stesso tempo, si attivano le cellule memoria che entrano in azione quando l’organismo, anche a distanza di anni, entra in contatto con quell’agente patogeno. La vaccinazione simula il primo contatto con l’agente infettivo per stimolare il sistema immunitario a produrre anticorpi specifici per quel particolare microrganismo. Virus dell’epatite B osservato al microscopio elettronico.

16 Animali transgenici Per animale transgenico s’intende un animale in cui un gene inizialmente estraneo, introdotto nella sua linea germinale, è portatore del carattere transgenico. Gli animali transgenici sono utilizzati in campo biomedico per: − studiare la funzione di geni specifici; − utilizzare un mammifero come bioreattore nella produzione di proteine umane; − correggere errori innati del metabolismo mediante terapia genica. Si possono seguire due tecnologie per modificare un animale dal punto di vista genetico: a. Microiniezione di uovo fecondato (zigote). Microiniezione di DNA b. Manipolazione di cellule staminali embrionali (ES).

Gli OGM: piante transgeniche 17 Gli OGM: piante transgeniche Con l’acronimo OGM s’intendono Organismi Geneticamente Modificati. Una tecnica utilizzata per preparare OGM è quella del trasferimento dei geni: si prepara un plasmide contenente DNA esogeno che viene inserito nella cellula batterica. Nel momento in cui il DNA esogeno si integra nei cromosomi di una cellula vegetale, questa si presenta trasformata. La pianta del tabacco è stata la prima ad essere preparata mediante processi biotecnologici. La pianta del tabacco modificata geneticamente è utilizzata per ricerche in vari ambiti, tra i quali la lotta all’inquinamento, la produzione di antiparassitari non tossici e la cura di malattie gravi come l’AIDS.

Le biotecnologie e le loro applicazioni 18 Le biotecnologie e le loro applicazioni Le biotecnologie costituiscono un insieme di processi naturali e di ingegneria genetica che vengono applicati in medicina, in agricoltura, nell’industria e nella protezione ambientale.

Le biotecnologie e le loro applicazioni 18 Le biotecnologie e le loro applicazioni Con il passaggio dalle tradizionali tecnologie di fermentazione alle moderne tecniche (DNA ricombinante, biochimica e biologia cellulare e molecolare) si sono registrati notevoli benefici in tre aree che si possono così riassumere: − industria applicata (medicine, enzimi, controllo dei cibi); − ambiente (diagnostica degli inquinanti, prodotti per la prevenzione degli inquinanti, biorimediazione); − energia (combustibili da risorse rinnovabili). Nell’industria chimica gli enzimi, catalizzatori di numerose reazioni, trovano applicazione in importanti prodotti.

Biotecnologie ambientali 19 Biotecnologie ambientali Le biotecnologie ambientali utilizzano i microrganismi per conservare l’ambiente e possono essere una importante risorsa per uno sviluppo sostenibile. La biodegradazione di sostanze chimiche tossiche, il trattamento delle acque inquinate e il biorisanamento (bioremediation) sono importanti tecniche che fanno ricorso al metabolismo dei microrganismi. Nel biorisanamento intervengono organismi naturali per abbattere sostanze tossiche o pericolose attraverso processi aerobici o anaerobici. Inquinamento marino da idrocarburi.