Anatomia e replicazione del genoma

Le funzioni vitali della cellula dipendono dal ruolo svolto da tre macromolecole biologiche: 1. DNA acido deossiribonucleico è il depositario dell’informazione genetica. Ognuna di queste informazioni si trova contenuta sotto forma di sequenza nucleotidica all’interno di un circoscritto segmento di DNA denominato gene L’insieme dei geni di una cellula, o organismo, viene chiamato, genoma 2. RNA acido ribonucleico (mRNA) sequenza nucleotidica che contiene le informazioni necessarie per la sintesi di una proteina 3. Proteine polimero di amminoacidi uniti da legami peptidici. Le proteine sono le macromolecole biologiche che compiono la maggior parte delle funzioni cellulari (es. Elementi strutturali, catalizzano reazioni chimiche, regolano l’espressione genica, fanno muovere e comunicare le cellule etc.).

Flusso dell’informazione genetica Il corretto svolgimento delle attività biologiche cellulari richiede il trasferimento dell’informazione genetica da una macromolecola biologica ad un’altra ad opera di tre diversi processi biochimici: Replicazione Trascrizione Traduzione Espressione genica Il linguaggio della sequenza nucleotidica dei due acidi nucleici viene tradotto in sequenza amminoacidica utilizzando un codice che fa corrispondere ad una tripletta nucleotidica presente nella sequenza di un gene un amminoacido, codice genetico Tutti i diversi mRNA di una cellula costituiscono il trascrittoma, l’insieme delle diverse proteine, proteoma

La struttura del gene eucariotico: esoni ed introni Sequenza discontinua, sequenza interrotta da regioni non codificanti di DNA introni.

Spliceosoma = complesso ribonucleoproteico fatto da 150 proteine e 5 RNA detti small nuclear RNA o snRNA, piccoli RNA nucleari Splicing alternativo può produrre forme diverse di mRNA e dunque di una proteina dallo stesso gene

Perché i geni eucarioti hanno gli INTRONI? 1- consentono lo splicing alternativo: grande flessibilità e potenzialità nella regolazione genica 2- in alcuni casi gli introni non vengono degradati e danno altri RNA funzionali nella regolazione genica ovvero alcuni tipi di ncRNA (RNA non codificanti) 3- possibile ruolo evolutivo consentendo l’evoluzione di geni con esoni diversi che codificherebbero per domini differenti della proteina. La ricombinazione tra introni di geni diversi può avere creato geni con nuove combinazioni di esoni: rimescolamento di esoni.

Dimensioni, contenuto e complessità dei genomi La dimensione del genoma dell’uomo è influenzata da: Esoni (1%) Introni (24%) DNA intergenico (75%) Sequenze ripetute che derivano da errori casuali che si verificano durante i processi di replicazione e ricombinazione del DNA. La dimensione di ogni genoma non sempre è correlata al grado evolutivo dell’organismo che lo ospita 4 milioni di basi E.Coli 3,2 miliardi di basi uomo Organismi più evoluti presentano un genoma più complesso

Organizzazione genetica del DNA altamente ripetitivo   satellite minisatellite microsatellite lunghezza dell'unità ripetitiva 150-200nt <25nt <5nt lunghezza dei raggruppamenti elevata intermedia contenuta localizzazione centromero telomero variabile

Aspetti generali sull’organizzazione fisica dei genomi Il compartimento cellulare deputato a contenere il materiale genetico, citoplasma per i procarioti, nucleo per gli eucaritoti, presenta dimensioni di diversi ordini di grandezza inferiore alla lunghezza del genoma ospitato Il DNA subisce dei ripiegamenti, torsioni e superavvolgimenti che gli fanno assumere la conformazione di una massa filamentosa e compatta

Assembl. ribosomi

L’involucro nucleare

Livelli di organizzazione della cromatina eucariotica Negli eucarioti il complesso che il DNA genomico forma con le proteine responsabili della sua condensazione viene chiamato cromatina In interfase: Eucromatina eterocromatina

interfase mitosi cromosomi

Corredo cromosomico umano

Un filamento polinucleotidico

Un filamento di acido nucleico è costituito da una successione di quattro diversi nucleotidi. Quindi c’è uno scheletro zucchero-fosfato costante e una sequenza di basi variabile che costituisce l’informazione Struttura a doppia elica con i filamenti orientati in modo antiparallelo Filamenti complementari

Struttura del DNA Un gene è un tratto di DNA in cui è contenuta l’informazione per la sintesi di una catena peptidica

Livelli di organizzazione della cromatina Graduale processo di condensazione consiste in un progressivo aumento dello spessore della fibra cromatinica ed a una riduzione della sua lunghezza

Livelli di organizzazione della cromatina Fibra cromatina con aspetto nodulare dovuto alla presenza di formazioni cilindriche chiamate nucleosomi Nucleosoma tratto di DNA avvolto attorno ad un complesso multiproteico formato da proteine basiche, istoni (H2A,H2B,H3,H4)

Livelli di organizzazione della cromatina Fibra cromatinica che spiralizzando forma una struttura elicoidale ad andamento periodo. Ogni spira è costituita da sei nucleosomi Istone H1 associa tra di loro due nuleosomi confinanti all’interno della stessa spira

Livelli di organizzazione della cromatina interfase mitosi formazione di anse associate a proteine della matrice nucleare Impilamento delle anse e successiva spiralizzazione determina la formazione del cromatide Cromosoma disteso Cromosoma condensato

Il cromosoma Telomeri:regioni che assicurano l’integrità del cromosoma

La replicazione del DNA La replicazione del DNA è una reazione biosintetica il cui risultato finale consiste nella produzione di due copie identitiche di genoma sintetizzate a partire da una unica e destinate a essere assegnate alle due cellule figlie durante la divisione cellulare fenomeno biologico correlato con l’attività proliferativa della cellula circoscritto alla fase S del ciclo cellulare è un processo semi-conservativo si svolge in modo simile in eucarioti e procarioti Dal punto di vista molecolare la replicazione del DNA può essere suddivisa in tre fasi denominate: Inizio Allungamento Terminazione

Complessi di modificazione della cromatina aggiunta di gruppi chimici a specifici residui amminoacidici 1.acetilazione 2.Metilazione Legame della metil-CpG binding protein alle “isole CpG” metilate che recluta co-respressori e istone deacetilasi

Complessi di rimodellamento della cromatina Esplicano i loro effetti utilizzando l’energia derivata dall’idrolisi dell’ATP ATPasi SW1/SNF: attività rimodellante attraverso cui il DNA avvolto attorno all’ottamero istonico viene allentato Fa scorrere il DNA nucleosomico spostando sequenze di regolazione trascrizionale verso zone maggiormente accessibili Dissocia un ottamero da un nucleosoma e lo associa a regioni distinte di DNA sono presenti anche enzimi che esercitano un’attività inibitoria sullo stesso processo biologico

La replicazione del DNA è semiconservativa

Fase di inizio della replicazione: riconoscimento e denaturazione dei siti di origine Le proteine iniziatrici riconoscono e legano sequenze di DNA chiamate “siti di origine” provocando al loro interno una distorsione della doppia elica inducendo una denaturazione circoscritta DNA elicasi ampliano la regione denaturata Proteine che legano il DNA a singola catena impediscono alla sequenza di DNA di rinaturarsi Topoisomerasi enzima che rimuove i superavvolgimenti del DNA che si formano ad azione dell’elicasi Nei procaritoti è presente un unico sito di origine OriC Negli eucarioti esistono siti multipli di replicazione presenti nelle varie molecole di DNA che costituisco il genoma eucariotico

Bolla replicativa Formata da due metà simmetriche a forma di Y chiamate “forcine replicative” le quali avanzano in direzione opposta

Fase di allungamento sintesi di DNA DNA polimerasi Legge lo stampo dal suo estremo 3’ verso quello 5’ mentre sintetizzano il prodotto della reazione dal suo estremo 5’ verso quello 3’ I nucleotidi trifosfato vengo aggiunti all’estremità 3’ del polinucleotide in crescita e scelti affinchè contengano la base azotata complementare a quella esposta sullo stampo

DNA polimerasi Necessita di un innesco per la sintesi del nuovo filamento di DNA Le DNA polimerasi possiedono attività esonucleasica 3’-5’ che consente loro di eliminare l’ultimo nucleotide 3’ del filamento in corso qualora questo sia stato erroneamente incorporato, correzione di bozze

Fase di allungamento sintesi bidirezionale di un filamento complementare a quello parentale Sintesi degli inneschi DNA primasi nei procarioti(primer RNA) DNA polimerasi a negli eucatioti (primer RNA/DNA) la replicazione richiede inneschi multipli ed è discontinua Una volta che gli inneschi sono stati sintetizzati sul filamento 3’ viene recluta la DNA polierasi III negli eucarioti e la DNA polimerasi d nei procarioti

FORCINA REPLICATIVA DNA polimerasi Attività esonucleasica 3’-5’, correzione di bozze Core enzimatico responsabile dell’attività DNA polimerasica Fattore di assemblaggio Morsa scorrevole, struttura ad anello che avvolge il filamento stampo e scorre su di esso Caricatore della morsa sul DNA a livello della giunzione innesco- stampo Nei procarioti: Dimero che assembla insieme i due core enzimatici impegnati nella sintesi formando un dimero di DNA polimerasi -Negli eucarioti:funziona come monomero, sul filamento guida e su quello tardivo operano due distinti apparati replicativi

La natura antiparallela della doppia elica crea una complicazione per la replicazione simultanea dei due filamenti. Poiché il DNA è sintetizzato aggiungendo nucleotidi in direzione 5’3’, soltanto uno dei due filamenti stampo può essere replicato in modo continuo seguendo la direzione della forcella di replicazione. Il DNA neosintetizzato a partire da questo stampo prende il nome di filamento continuo (leading strand). La replicazione dell’altro filamento è più problematica, in quanto la DNA polimerasi III deve muoversi in direzione opposta rispetto a quella della forcella di replicazione. Il filamento di DNA neosintetizzato da questo stampo è conosciuto come filamento ritardato (lagging strand) e la sintesi avviene in maniera discontinua, mediante la formazione dei frammenti di Okazaki.

Fase di terminazione La fase dell’allungamento si conclude quando viene portata a completamento la polimerizzazione dei filamenti neo sintetizzati Rimozione degli inneschi e risintesi di DNA -nei procarioti reclutamento di DNA polimerasi I con attività esonucleasica 5’-3’ e polimerasica (sostituzione delle polierasi) - negli eucarioti viene reclutato l’enzima FEN1 che insieme a DNA elicasi e ribonuleasi H rimuove l’innesco, la DNA polimerasi d risintetizza la regione dell’innesco La DNA ligasi forma un legame fosfodiesterico fra i frammenti di DNA formati Si ritiene che la terminazione della replicazione del DNA avvenga quando due forcine replicative che procedono in direzione opposta si incontrano. Il contatto provoca il distacco dei due apparati replicativi e le due estremità neo-sintetizzate vengono unite dalla DNA ligasi .

DNA telomerico I telomeri rappresentano le estremità dei cromosomi lineari. Sono costituiti da una regione a doppio filamento e da una porzione a singolo filamento. Il DNA telomerico presenta ripetizioni in tandem di sequenze nucleotidiche.

Le sequenze ripetute in tandem alle estremità dei cromosomi sono specie specifiche. Nell’uomo, come in tutti i vertebrati, la sequenza è 5’-T2AG3-3’. La tabella, inoltre, mostra che la lunghezza dei telomeri è diversa nelle varie specie, nell’uomo è di 5-15kb. SPECIE LUNGHEZZA TELOMERO SEQUENZA TELOMERO Ciliati T. thermophila 120-140 bp T2G4 Lieviti S. cerevisiae 200-300 bp TG2-3(TG)11-6 Vertebrati Uomo 5-15 kb T2AG3 Topo Oltre 150 kb Ratto 20-100 kb Uccello 5-20 kb Invertebrati Formica 9-13 kb T2AG2 Piante A. thaliana 2-5 kb T3AG3

L’erosione dei telomeri: “end replication problem” I telomeri perdono approssimativamente 50-200 bp per ogni divisione cellulare a causa del cosiddetto “end replication problem”. il meccanismo di replicazione del DNA non è in grado di replicare completamente le estremità dei cromosomi lineari, con conseguente erosione dei telomeri L’enzima telomerasi promuove un allungamento compensatorio dei telomeri Per la replicazione del DNA è necessaria la sintesi di frammenti di RNA utilizzati come inneschi. La necessità di avere inneschi a RNA crea un problema per la replicazione delle parti terminali dei cromosomi lineari. Infatti, una volta rimosso l’ultimo innesco all’estremità 5’ del filamento ritardato e del filamento veloce, non è più possibile replicare l’estremità 3’ dello stampo. Di conseguenza, si formano estremità ssDNA al 3’, di grandezza pari a quella dell’innesco rimosso. Questo meccanismo porterebbe alla perdita di materiale genetico di generazione in generazione.

La telomerasi La telomerasi è una ribonucleoproteina composta di due parti essenziali: una componente catalitica , trascrittasi inversa, che catalizza la sintesi di porzioni di DNA complementari alla molecola di RNA contenuta all’interno del suo sito catalitico e che, pertanto, funge da stampo e una molecola di RNA complementare al filamento 3’ protusivo

Meccanismo d’azione della telomerasi a) il DNA telomerico è riconosciuto dalla telomerasi, l’estremità 3’ del DNA forma un ibrido con l’RNA stampo della telomerasi b) la telomerasi catalizza l’aggiunta di nucleotidi all’estremità 3’, usando come stampo l’RNA. c) la telomerasi trasloca d) determina l’aggiunta di ulteriori nucleotidi all’estremità 3’. Dopo un determinato numero di cicli, la primasi sintetizza un innesco ad RNA utilizzando come stampo l’estremità 3’. La DNA polimerasi I catalizzerà l’aggiunta di nucleotidi e, quindi, la replicazione del tratto neo-sintetizzato dalla telomerasi (Autexier e Lue, 2006).