STUDIO DI DUE CASI CON DUPLICAZIONE Xq: FENOTIPO CLINICO E RUOLO DELLA INATTIVAZIONE DEL CROMOSOMA X S. Bigoni1, S. Brioschi1, B. Buldrini1, A. Bonfatti1, V. Aiello1, R. Gruppioni1, L. Rocchetti3, A. Marsciani2, A. Armaroli1, S. Fini1, F. Gualandi1, A. Ferlini1 1 U.O. Genetica Medica, Az.Ospedaliera Universitaria-Ferrara 2 U.O. Pediatria, Dip. Mat. Infantile, AUSL - Rimini 3 U.O. Genetica Medica A.V. Romagna Le duplicazioni di grandi dimensioni del braccio lungo del cromosoma X, visibili citogeneticamente, sono di raro riscontro anche se la prevalenza non è nota in considerazione della possibilità di quadri asintomatici. Nei maschi questi riarrangiamenti comportano una disomia funzionale del segmento duplicato che si associa ad un grave quadro clinico. Nelle femmine sintomatiche la relazione fra le duplicazioni osservate ed il fenotipo non è ben definito, le più frequenti manifestazioni sono rappresentate fondamentalmente da bassa statura, ritardo dello sviluppo, dismorfismi facciali e disgenesia ovarica. La sintomatologia è attribuita alla presenza di disomia funzionale dovuta ad una modalità di inattivazione random del cromosoma X, alla presenza di regioni nel segmento duplicato che sfuggono alla inattivazione, a pattern di inattivazione diversi da tessuto a tessuto, ad effetti locali nei punti di rottura oppure a mutazioni di geni recessivi sul cromosoma X attivo (1). Caso I La paziente (38 aa) presenta un fenotipo caratterizzato da bassa statura proporzionata, lievi dismorfismi con macrocefalia, obesità ed irregolarità mestruali (periodi di amenorrea fino a 6 mesi). Accertamenti effettuati: Ecografia addome (completa di valutazione delle logge renali) e pelvica: nella norma, in particolare non anomalie a carico di utero ed annessi. Rx mano: assenza di alterazioni morfologiche a carico dei diversi raggi, segno di Archibald negativo. Calcio, fosforo, fosfatasi alcalina, paratormone, calcitonina, FSH, LH, 17 beta estradiolo, testosterone tutti nella norma; ipertrigliceridemia, ipercolesterolemia, iperinsulinismo. Elementi significativi emersi alla visita genetica sono: peso 83 Kg (>97°P), altezza 143,5 cm (<5°P), span 143,5 cm, CC 56 cm (90-97°P), forma del volto rotondeggiantre, telecanto e rime palpebrali corte, lunghezza di mano e palmo al di sotto del 3°p, Obesità importante, prevalentemente a distribuzione ginoide (BMI: 40,6, corrispondente ad obesità di III grado) All’analisi aCGH la duplicazione è risultata di 44 Mb “de novo” e comprende il segmento Xq22-Xq27. Lo status di inattivazione del cromosoma X mette in evidenza una inattivazione preferenziale del 100%. Fig. 1 Riportiamo due casi sintomatici con duplicazione Xq giunti alla nostra osservazione e caratterizzati alivello molecolare con analisi aCGH e con analisi di metilazione del gene AR (Xq13). Fig. 2 Caso II La paziente (7 aa) presenta bassa statura armonica a -3 SD dalla norma resistente alla terapia con GH associata ad un lieve ritardo mentale che richiede sostegno scolastico. Sono presenti note dismorfiche caratterizzate da ipertelorismo e micrognazia. All’analisi con aCGH la duplicazione risulta di 24 Mb “de novo” e si estende da Xq25 a Xq28. Non è stato possibile effettuare lo studio di inattivazione del cromosoma X in quanto il polimorfismo (CAG)n del gene AR non è risultato informativo. METODI La metodica aCGH è stata eseguita, secondo le indicazioni della ditta fornitrice, utilizzando il CytoChip Isca 4x44 K (Bluegnome,Ltd) con risoluzione media sul backbone di 75Kb ed effettuando l’analisi con il software Bluefuse Multi (Bluegnome, Ltd) Il pattern di inattivazione del cromosoma X è stato determinato utilizzando il test di metilazione del recettore degli androgeni (AR). Il repeat polimorfico (CAG)n è stato amplificato mediante reazione di PCR ed il prodotto di amplificazione analizzato su sequenziatore automatico ABI 3130. Gli alleli sono stati tipizzati utilizzando il software Genemapper (Applied Biosystems). Nelle portatrici risultate informative per il polimorfismo, 1µg di DNA è stato digerito con 10U degli enzimi metilazione-sensibili HpaII e CfoI e il prodotto di digestione è stato amplificato in PCR secondo le modalità sopra descritte. I prodotti di amplificazione del DNA non digerito e del DNA digerito sono stati analizzati in parallelo su sequenziatore automatico. Per compensare l’amplificazione ineguale dei due alleli, è stato definito un valore di correzione, calcolato come rapporto tra i due alleli amplificati nel DNA non digerito, che è stato poi applicato al valore degli alleli ottenuti dal campione digerito. Il grado di inattivazione del DNA nel campione digerito è stato calcolato normalizzando la somma dei due alleli al 100%. Conclusioni In rari casi la presenza di duplicazioni nel braccio lungo del cromosoma X nelle femmine è associato ad una sintomatologia variabile i cui segni sono rappresentati essenzialmente da bassa statura, ritardo dello sviluppo, microcefalia e dismorfismi minori. I due casi presentati sono caratterizzati da una bassa statura armonica e da lievi dismorfismi, nel caso I non sono presenti disabilità intellettive e a differenza di altri casi descritti in letteratura è presente macrocefalia, mentre l’obesità è stata descritta in un altro caso con duplicazione Xq23q25 in un quadro descritto come Prader-Willi-like e caratterizzato da una inattivazione X random (2). Fra le diverse possibili cause all’origine delle manifestazioni cliniche, gli effetti di dosaggio conseguenti alla presenza di disomia funzionale è ampiamente accettata. Dai dati in letteratura emerge che, come nelle femmine fenotipicamente normali, la maggior parte dei casi sintomatici presentano una inattivazione preferenziale completa del cromosoma riarrangiato (3) e questo dato è stato confermato in uno dei nostri due casi (caso I - fig. 3), mentre nell’altro (caso II) non è stato possibile effettuare l’analisi per assenza di polimorfismo. Tuttavia il test di inattivazione molecolare, basato sull’analisi di metilazione AR, dà una immagine unitaria del cromosoma indagato e quindi non permette di individuare eventuali pattern di inattivazione parziali nelle regioni riarrangiate. Più utile a questo scopo può risultare, a livello citogenetico, lo studio di incorporazione della BrdU (3) e, per uno studio approfondito a livello molecolare, l’applicazione della tecnologia NGS per studi di genomica funzionale. Fig. 3 Polimorfismo (CAG)n del gene AR Campione non digerito Campione dopo digestione con HpaII-CfoI Inattivazione = 100:0 1) Sanlaville D, Schluth-Bolard C, Turleau C. Orphanet J Rare Dis. 2009 Feb 20;4:4. Review. 2) Monaghan KG, Van Dyke DL, Feldman GL. Am J Med Genet. 1998 Nov 16;80(3):227-31. 3) Armstrong L, McGowan-Jordan J, Brierley K, Allanson JE. Am J Med Genet A. 2003 Jan 1;116A(1):71-6. Review.