Crystallization X-ray Diffraction data collection 1. Grow crystals 2. Measure diffraction X-ray Diffraction data collection

La morfologia del cristallo spesso è direttamente correlata al pH. In alcuni casi, il pI è il valore di pH al quale si ha la migliore crescita del cristallo.

Sali non caotropici Sali caotropici Interagiscono con l’acqua, provocano la formazione di interazioni tra le molecole di proteina Sali non caotropici Inducono denaturazione nelle molecole proteiche interagendo con gli elementi di struttura secondaria Sali caotropici

Raggiunto una certa concentrazione di sali si ha l’effetto salting-out La solubilità diminuisce all’aumentare della forza ionica log s = A - Ks I/2 A e Ks sono costanti empiriche, Ks è la costante di salting-out ed è caratteristica del sale

MPD 2-metil-2,4-pentandiolo L’effetto dei solventi organici sul processo di cristallizzazione è molto simile a quello dei polimeri. Le molecole organiche competono con le molecole di proteina per il solvente, e abbassano la costante dielettrica della soluzione. Questi effetti comportano la formazione di interazione tra le macromolecole. Ad alte concentrazioni alcuni solventi organici possono destabilizzare le macromolecole MPD 2-metil-2,4-pentandiolo 2,5-esandiolo

Tecniche di Cristallizzazione

Le tecniche di cristallizzazione devono raggiungere la soprasaturazione e mantenere le condizioni di crescita del cristallo. La cristallizzazione è condotta su scala microscopica

DIFFUSIONE IN FASE VAPORE La diffusione in fase vapore è il metodo più utilizzato tra quelli in uso perché permette di esplorare un grande numero di condizioni di cristallizzazione. Ha il vantaggio di usare piccole quantità di proteina. Una goccia contenente la macromolecola, un tampone ed un agente precipitante viene equilibrata in un contenitore, chiuso ermeticamente, contenente una soluzione del precipitante. L'equilibrio si raggiunge per evaporazione delle specie volatili finché la tensione di vapore della goccia eguaglia quella del serbatoio. In questo modo si ottiene il graduale raggiungimento del punto di soprasaturazione.

HANGING DROP 4 μl soluzione 2 μl proteina 2 μl soluzione precipitante vetrino silicone ~ 1 ml di soluzione precipitante

SITTING DROP vetrino 2 μl proteina + 2 μl soluzione precipitante silicone ~ 1 ml di soluzione precipitante

SANDWICH DROP 10 μl proteina + 10 μl soluzione precipitante vetrino silicone ~ 1 ml di soluzione precipitante

Plates per la cristallizzazione Ponti per il sitting drop

Diagramma di fase per la diffusione in fase vapore

Diagramma di fase per la diffusione in fase vapore

BATCH E MICROBATCH La tecnica più semplice per ottenere cristalli in cui la soluzione di proteina concentrata è mescolata direttamente con la soluzione concentrata di precipitante, in modo da ottenere la concentrazione finale di soprasaturazione. Lo svantaggio principale è la quantità relativamente grande di proteina da usare. Inoltre non è molto adatto per provare un intervallo ampio di condizioni di cristallizzazione. La tecnica microbatch permette di usare quantità molto limitate di proteina. Piccole gocce (pochi μl) della soluzione di proteina e agente precipitante vengono ricoperte da un olio trasparente e molto denso che impedisce l'evaporazione del solvente dalla goccia.

BATCH vetrino silicone proteina + soluzione precipitante

MICROBATCH 1 μl proteina + 1 μl soluzione precipitante olio di paraffina

Plates per la cristallizzazione in microbatch Robot per la cristallizzazione in microbatch

Diagramma di fase per batch

DIALISI Una macromolecola può essere portata lentamente verso il suo punto di precipitazione per dialisi contro una soluzione concentrata di sale o di solvente organico. Al diminuire della differenza di concentrazione tra l'interno e l'esterno della membrana la velocità di raggiungimento dell'equilibrio diminuisce. Con la dialisi è possibile esplorare un intervallo virtualmente continuo di pH e di concentrazione di agente precipitante, cambiando le condizioni esterne al sacchetto da dialisi. La dialisi classica necessita di una notevole quantità di proteina. Questo problema viene risolto sostituendo il tradizionale sacchetto da dialisi con un bottone da dialisi in Plexiglas (7-200 μl).

membrana semipermeabile DIALISI membrana semipermeabile elastico proteina bottone da dialisi agente precipitante

Diagramma di fase per la dialisi

Diagramma di fase per la dialisi

DIFFUSIONE LIBERA ALL’INTERFACCIA La cristallizzazione mediante diffusione libera all'interfaccia rappresenta un tentativo di ottenere condizioni transienti di elevata soprasaturazione, necessarie per la nucleazione, seguite da condizioni di minore soprasaturazione, necessarie per la crescita, in un unico esperimento. Inizialmente le molecole all'interfaccia liquido-liquido si trovano in condizioni di elevata soprasaturazione, mentre il resto della soluzione di proteina rimane nelle condizioni iniziali. Le condizioni di elevata soprasaturazione all'interfaccia promuovono la formazione dei nuclei. All'equilibrio, quando le soluzioni di proteina e di agente precipitante sono completamente mescolate, tutta la soluzione di proteina diventa soprasatura.

DIFFUSIONE LIBERA ALL’INTERFACCIA capillare agente precipitante proteina cera