Risultati e Discussione Riferimenti Bibliografici FUMONISINE B1 E B2 IN PRODOTTI ALIMENTARI A BASE DI MAIS: OTTIMIZZAZIONE E VALIDAZIONE DEL METODO ANALITICO MEDIANTE HPLC-FLD CON DERIVATIZZAZIONE CHIMICA POST-COLONNA E MONITORAGGIO SU CAMPIONI REALI UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI FOGGIA S. Lo Magroa, D. Nardielloa, M. Campanielloa, M. Iammarinoa, C. Palermo b, M. Muscarellaa a Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata, Foggia; b Dipartimento di Scienze Agro-Ambientali, Chimica e Difesa Vegetale, Università degli Studi di Foggia Introduzione Le fumonisine sono micotossine prodotte dal metabolismo di funghi appartenenti al genere Fusarium, in particolare F.moniliforme e F.proliferatum, contaminanti diffusi del mais ed altri cereali tra cui sorgo e riso [1-3]. Tra le numerose forme di fumonisine finora identificate negli alimenti contaminati vengono, generalmente, rinvenute quelle di tipo B (FB1, FB2 e FB3). Nel 2002 l’Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro (IARC) ha classificato la FB1 nel gruppo 2B, quale potenziale agente cancerogeno per l’uomo. La maggiore diffusione e tossicità della FB1 e la minore concentrazione della FB3 consentono di semplificare le indicazioni legislative riferendo i valori soglia, fissati nel Reg. (CE) 1126/2007, per il granoturco e i prodotti da esso derivati, alla sola somma di FB1 e FB2. Il controllo della contaminazione da fumonisine nel mais è diventato un argomento rilevante nelle ricerche inerenti la sicurezza alimentare. Nel presente lavoro è descritta la metodica analitica per la determinazione delle fumonisine mediante cromatografia liquida ad alte prestazione e rivelazione fluorimetrica, previa derivatizzazione post-colonna con o-ftalaldeiede (OPA) e N,N-dimetil-2-mercaptoetilammina (Thiofuor™). La metodica analitica ottimizzata, sensibile e di facile utilizzo, è stata sottoposta a procedura di validazione e quindi applicata all’analisi di una serie di matrici alimentari a base di mais [4]. Il monitoraggio è stato eseguito su 100 campioni (8 di farina di mais, 21 di polenta, 7 di mais, 35 di corn-flakes, 16 di snacks e 13 di prodotti per celiaci), acquistati negli anni 2007-2008 in diversi punti vendita della Puglia e della Basilicata. Risultati e Discussione La combinazione di una semplice procedura di clean-up (IAC) con la derivatizzazione chimica post-colonna con OPA abbinata alla rivelazione fluorimetrica consente di ottenere una elevata affidabilità e sensibilità di analisi con limiti di rivelabilità inferiori a 15 µg/kg (Tabella 2). In Figura 2 è mostrato il confronto tra il profilo cromatografico della miscela standard di FB1 e FB2 e un campione di polenta, naturalmente contaminato. Tabella 2. Parametri di calibrazione a y è il segnale espresso in unità di luminescenza (LU). b x è il valore della concentrazione in μg/L. c Coefficiente di correlazione. d Valori di concentrazione espressi in μg/kg. Tabella 4. Risultati dell’indagine sulla presenza di FB1 e FB2 a Valori riferiti ai soli campioni contaminati (c > 15 µg/kg). Le fumonisine B1 e B2 sono state riscontrate in concentrazioni superiori al limite di rivelabilità in tutti i campioni di polenta e di farina di mais, in 4 di mais, in 10 di corn-flakes, in 12 di snacks e in 7 prodotti per celiaci (pasta, gallette, biscotti). Livelli di contaminazione superiori ai limiti normati sono stati osservati in 4 campioni di polenta, in 3 di farina di mais ed in 1 di mais, mentre non sono stati rilevati campioni positivi tra cereali da colazione, snacks ed alimenti per celiaci (Figura 3). Una minore incidenza di contaminazione è stata osservata nell’anno 2008 (7%) rispetto al 2007 (19%). Figura 3. Contenuto di fumonisine in prodotti alimentari a base di mais Materiali e Metodi Le analisi cromatografiche sono state condotte applicando le condizioni sperimentali ottimizzate riportate nella Tabella 1. Tabella 1. Condizioni sperimentali ottimizzate Conclusioni Nel presente lavoro di ricerca è stato messo a punto ed ottimizzato un metodo analitico, rapido, sensibile ed automatizzato per la determinazione delle fumonisine B1 e B2 in prodotti alimentari destinati al consumo umano. Il metodo è basato sulla cromatografia liquida ad alte prestazioni abbinata alla rivelazione fluorimetrica previa derivatizzazione chimica post-colonna mediante o- ftalaldeide e Thiofluor™. La validazione eseguita in accordo con quanto definito nel Reg. 822/2004/CE, ha dimostrato la rispondenza dei requisiti analitici del metodo ai criteri previsti nel Reg. 401/2006/CE, confermandone l’affidabilità nella valutazione della contaminazione da fumonisine nei prodotti alimentari a base di mais nelle analisi di controllo ufficiale. Dall’indagine svolta sui 100 prodotti alimentari è emerso che il 54% dei campioni analizzati risulta contaminato da fumonisine ad un livello maggiore del LOD (15 µg/kg), ma inferiore al limite legale, espresso come somma FB1+ FB2. Soltanto tra mais, polenta e farina di mais, si riscontrano campioni non conformi (C > 1000 µg/kg) con percentuali variabili nell’intervallo 14-38%. Figura 2. (A) Soluzione standard 160 g/L di FB1 e FB2 e (B) campione di polenta naturalmente contaminato. Il metodo ottimizzato è stato quindi validato in accordo con quanto stabilito dal Reg. 882/2004/CE. Sono state valutate le performances analitiche quali specificità, linearità, ripetibilità, recupero, limite di rivelabilità (LOD) e quantificazione (LOQ), dimostrando la rispondenza dei requisiti analitici (Tabella 3) ai criteri previsti dal Regolamento 401/2006/CE. Prima dell’analisi, ogni campione è stato finemente omogeneizzato e le fumonisine sono state estratte con una miscela di acetonitrile/metanolo/acqua e purificate su cartucce di immunoaffinità (IAC) contenenti anticorpi monoclonali immobilizzati [4]. In figura 1 è riportata la rappresentazione schematica dell’apparato strumentale. Tabella 3. Parametri di validazione valutati su campioni di cornflakes additivati Riferimenti Bibliografici C. Paepens, S. De Saeger, L. Sibanda, I. Barna-Vetró, I. Léglise, F. Van Hove, C. van Peteghem, Anal. Chim. Acta 523 (2004) 229. G.S. Shephard, P.G. Thiel, S. Stockenström, E.W. Sydenham, J.AOAC Int. 79 (1996) 671. M.W. Trucksess, J. AOAC Int. 84 (2001) 202. M. Muscarella, S. Lo Magro, D. Nardiello, C. Palermo, D. Centonze, J. Chromatogr. A 1203 (2008) 88. I risultati del monitoraggio in 100 campioni alimentari a base di mais, espressi come somma delle fumonisine B1 e B2, sono riportati nella Tabella 4, dove è mostrata sia la percentuale di campioni contaminati (ad una concentrazione superiore al limite di rivelabilità del metodo, pari a 12 µg/kg per FB1 e 15 µg/kg per FB2), sia la percentuale di campioni non conformi secondo il Reg. (CE) 1126/2007. Lavoro eseguito con i fondi di ricerca corrente del Ministero della Salute (Progetto RC–IZS PB 004/07). Si ringrazia P. D’Antini (Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata – FOGGIA) per la collaborazione tecnica. Figura 1. Rappresentazione schematica dell’apparato strumentale HPLC/FLD con derivatizzazione chimica post-colonna. III CONGRESSO NAZIONALE: LE MICOTOSSINE NELLA FILIERA AGRO-ALIMENTARE E ZOOTECNICA, Roma 28-30 Settembre 2009