L’isolamento dei funghi fitopatogeni Laboratorio n° 3: L’isolamento dei funghi fitopatogeni

Indice della lezione Sezione teorica 1.1. I postulati di Koch 1.2. Isolamento di fughi fitopatogeni 1.3. I substrati base 1.4. I substrati selettivi Attività di laboratorio 3.1. Preparazione dei substrati (PDA e PDA + AL) 3.2. Pulizia dei tessuti vegetali 3.3. Prelievo dei tessuti vegetali 3.4. Piastramento dei tessuti vegetali

I postulati di Koch I postulati di Koch sono originalmente dei criteri destinati a stabilire la relazione di causa-effetto che lega un microrganismo ad una malattia. Koch isolò dai tessuti di animali malati i bacilli del carbonchio, li coltivò in laboratorio e ne identificò il ciclo vitale di tipo sporigeno. Attraverso l'inoculazione delle cellule in animali non affetti da alcuna patologia osservò l'insorgenza della malattia e la possibilità di isolare tale microrganismo dal tessuto degli animali infettati sperimentalmente. Questi criteri sono conosciuti appunto come postulati di Koch. Robert Koch fu il primo ad adottare sperimentalmente alcuni criteri utili per stabilire se un certo microrganismo sia o meno la causa di una certa malattia. I postulati sono i seguenti: 1_ deve essere possibile isolare il microrganismo dall'ospite malato e farlo crescere in coltura pura 2_ ogni volta che una coltura pura del microrganismo viene inoculata in un ospite sano (ma suscettibile alla malattia), si riproduce la malattia 3_il microrganismo deve poter essere isolato nuovamente dall'ospite infettato sperimentalmente.

I postulati di Koch 1° 3° 2°

L’isolamento dei funghi fitopatogeni  I microrganismi in natura non vivono mai in coltura pura ma sempre in comunità microbiche diversificate. In particolare nel suolo e nei residui vegetali sono presenti comunità miste composte da organismi patogeni (capaci di una fase saprofitaria) e saprofiti  I microrganismi esclusivamente saprofiti hanno una maggiore capacità di colonizzare la sostanza organica morta rispetto ai funghi fitopatogeni  L’isolamento di funghi fitopatogeni in presenza di microrganismi saprofiti può essere difficoltosa, in particolare in presenza di tessuti in fase avanzata di decomposizione. Conseguentemente si può facilmente incappare in diagnosi errate.

I substrati nutritivi base  Numerosi microrganismi saprofiti possono essere coltivati su substrati liquidi o solidi (agarizzati) contenenti: fonti di carbonio organico (glucosio, mannitolo, cellulosa, amido ecc ecc) nutrienti in forma minerale o organica (N minerale oppure organico presente nelle proteine, nei peptidi o negli aminoacidi) minerali e vitamine  PDA (Potato dextrose agar) e PDB (Potato dextrose broth) Estratto di patata (4 g /l) Destrosio (20 g / l) Agar (15 g / l)  I substrati generici sono in gradi di supportare la crescita di una grande varietà di microbi (funghi, batteri, attinomiceti), quindi hanno una bassa selettività

I substrati nutritivi selettivi  Può essere necessario isolare solo un gruppo di microrganismi (funghi vs. batteri) o una singola specie di microrganismo da una comunità microbica diversificata. In tal caso è necessario ricorrere ai substrati selettivi.  La selettività si basa su principi: 1_Inibizione selettiva: si basa sull’utilizzo di prodotti con attività antimicrobica (comunemente antibiotici) verso alcuni microbi ma con attività assente o ridotta verso l’organismo target. Es: antibiotici attivi contro batteri gram positivi (penicillina, vancomicina) contro i gram negativi (streptomicina) e ad ampio spettro (tetraciclina, kanamicina, cloramfenicolo ecc) ed attivi anche contro i funghi (pimaricina ecc). Spesso sono utilizzati anche fungicidi commerciali (pentacloronitrobenzene = PCNB ecc) 2_Stimolazione selettiva: si basa sull’utilizzo di fonti di carbonio o nutrienti assimilabili esclusivamente o preferenzialmente dall’organismo target che risulta così favorito nella competizione per il substrato. Es: mannitolo, cellobiosio, amido ecc. 3_Alterazione delle condizioni “ambientali”: si basa sull’utilizzo di molecole che non sono tossiche o substrati nutritivi ma che alterano le “condizioni ambientali del substrato” (acidità, pressione osmotica, alcalinità). Es: acido lattico che abbassando il pH fino a 3,5 favorisce i fughi a discapito dei batteri.

Isolamento di funghi fitopatogeni (1:3)  Isolamento da foglie e radici infette: - Piante di lattuga e/o cavoli attaccati da Sclerotinia sclerotiorum  Isolamento da frutti: - frutti di agrumi con attaccati da Penicillium italicum e Penicillium spp.

Protocollo di isolamento (2:3)  1_Pulizia superficiale - Primo lavaggio superficiale in acqua corrente. Segue un lavaggio in ipoclorito di sodio (3%) per 5 minuti. Segue un lavaggio in acqua sterile per eliminare l’ipoclorito.  2_Taglio e prelievo del campione - dimensioni del campione infetto da asportare (1-3 mm) - asportare 6-10 porzioni di vegetale da ogni campione - la zona di incisione va scelta accuratamente, evitando aree in avanzato stato di decomposizione - porre particolare attenzione nell’uso del bisturi  3_Lavaggio in acqua sterile - i campioni devono essere lavati in acqua sterile tre volte (2-3 minuti per ogni lavaggio) - al termine dei lavaggi i campioni devono essere posti ad asciugare in condizioni di sterilità  4_Utilizzo del substrati - i campioni lavati devono essere posti sul substrato selezionato in condizioni di sterilità

Protocollo di isolamento (3:3)  Computo materiali - campioni vegetali infetti (cavoli-rapa attaccati da Sclerotinia sclerotiorum; frutti di agrumi attaccati da Penicillium italicum e Penicillium spp.) - bisturi (n° 6) - PDA (2 beute da 500 ml) - Acido Lattico sterile da aggiungere al PDA (5-10 gocce l-1) - Piastre petri sterili (n° 30) - Acqua sterile (500 ml) - Falcon sterili da 15 ml (n° 15)