SPERIMENTAZIONE DI NUOVE TECNICHE PER IL XIV Congresso Nazionale Associazione Italiana di Aerobiologia (AIA) – Trent’anni di Aerobiologia in Italia– 24-26 settembre 2015 SPERIMENTAZIONE DI NUOVE TECNICHE PER IL MONITORAGGIO AEROBIOLOGICO: IDENTIFICAZIONE DI SPECIE DI POACEAE TRAMITE ANALISI BIOMOLECOLARI SUL POLLINE AERODIFFUSO Sofia Ghitarrini*, Emidio Albertini*, Giuseppe Frenguelli* *Dipartimento Scienze Agrarie, Alimentari e Ambientali (DSA3) – Università degli Studi di Perugia sofia.ghitarrini@studenti.unipg.it Stagione pollinica delle Poaceae a Perugia Il grafico mostra la curva di pollinazione cumulativa per tutte le specie di Poaceae presenti nell’area del catturatore, ed è mediata sui dati raccolti dal 1982 al 2014. INTRODUZIONE Le Poaceae sono una famiglia di piante ubiquitarie ed estremamente adattabili. Nonostante la loro importanza economica, esse possono rappresentare un problema per la salute umana, data l’abbondanza di polline allergenico che molte specie producono e rilasciano in atmosfera. Per poter somministrare terapie allergene-specifiche ai pazienti sensibili, sono necessarie indicazioni dettagliate sulla specie causativa e la sua stagione pollinica. Tuttavia, il monitoraggio aerobiologico classico non può fornire tale informazione per le Poaceae, data la similarità morfologica dei pollini in questa famiglia. Questo studio propone l’utilizzo di tecniche biomolecolari per la loro identificazione specie-specifica. MATERIALI E METODI Fase 1: Le specie analizzate, scelte in base alla loro diffusione nell’area di Perugia (Umbria, Italia Centrale) e alla gamma di allergeni contenuti, sono state: Poa pratensis, Dactylis glomerata, Phleum pratense, Lolium perenne e Festuca arundinacea. Fase 2: Il loro DNA estratto da foglia è stato sottoposto a PCR con tre coppie di primer Poaceae-specifici, diretti a regioni polimorfiche del genoma. Fase 3: Gli ampliconi del gene Maturase K, risultato il più adatto all’analisi, sono stati sequenziati, allineati e ne sono stati evidenziati i polimorfismi, allo scopo di disegnare nuovi primer specie-specifici. Sono state poi ottimizzate le condizioni di PCR di questi ultimi per ottenere amplificazione specifica. Fase 4: Il protocollo di un kit commerciale è stato modificato per l’estrazione del DNA totale dal supporto di monitoraggio con i pollini adesi (melinex) ottenuto dal campionamento effettuato di routine tramite una Hirst-spore trap4. Questo materiale genetico è stato analizzato con i primer specie-specifici ottenuti per verificare la presenza delle specie in atmosfera. Morfologia del granulo pollinico delle Poaceae I granuli sono monoporati, apolari, sferoidali, di dimensioni medie e raramente grandi. Il diametro, estremamente eterogeneo, può variare dai 18 ai 70 µm. L’intina è più spessa dell’esina, specialmente intorno al poro1. Le ridotte differenze morfologiche tra pollini di specie diverse non ne permettono la discriminazione con la sola analisi microscopica. Dactylis glomerata waxy 2 (Granule Bound Starch Synthase II – GBSSII) mat K3 (Maturase K – plastidial) rbcL3 (Rubisco Large Subunit – plastidial) Poa pratensis Unico poro con opercolo e annulus Tectum areolato-scabrato o finemente granulato Festuca arundinacea Phleum pratense ~ 30 m Lolium perenne RISULTATI Ottimizzazione condizioni di PCR per i primer specie-specifici ottenuti Analisi del DNA estratto dal melinex con i primer specie-specifici Test dei primer Poaceae-specifici sul DNA estratto da foglie W1 W2 C- LOLIUM POA FESTUCA W1: Settimana dal19/05/2014 al 25/05/2014; W2: Settimana dal 26/05/2014 al 01/06/2014; C- : Controllo negativo. 3000 bp 1000 bp 500 bp ~900 bp Dac Phl Lol Fes Poa Fotografia del gel di elettroforesi ottenuto da una PCR effettuata con la coppia di primer Poaceae-specifici (famiglia – specifici) diretti al gene plastidiale Maturase K, utilizzando come stampo il DNA estratto dalle cinque specie di interesse. L’efficienza di estrazione del DNA totale da melinex con pollini adesi ottenuta è ancora bassa, rendendo poco affidabile il risultato dell’analisi con i primer specie-specifici. Questa fase necessita di ulteriore ottimizzazione. La coppia di primer mat K è risultata la migliore candidata per l’analisi, in quanto capace di generare un unico amplicone stabile, di dimensioni omogenee e in buona concentrazione in tutte e cinque le specie. Sono state ottenute bande specifiche, con le temperature di annealing indicate, sul DNA di Festuca a., Lolium p. e Poa p.. Le prove sono ancora in corso su Dactylis g. e Phleum p.. References: Perveen A (2006) A contribution to the pollen morphology of family Gramineae. World Applied Science Journal 1(2):60-65. Longhi S, Cristofori A, Gatto P, Cristofolini F, Grando MS and Gottardini E(2009) Biomolecular identification of allergenic pollen: a new perspective for aerobiological monitoring? Ann Allergy Asthma Immunol., 103:508–514. Drumwright AM, Allen BW, Huff KA, Ritchey PA and Cahoon BA (2011) Survey and DNA Barcoding of Poaceae in Flat Rock Cedar Glades and Barrens State Natural Area, Murfreesboro, Tennessee. Castanea 76(3):300-310. Hirst JM (1952) An automatic volumetric spore trap. Ann App Biol, 39:257-265. CONCLUSIONI Una volta messo a punto il protocollo di estrazione del DNA dal supporto di monitoraggio, sarà possibile verificare la presenza o meno in atmosfera in un dato momento, del polline delle specie analizzate. Tale informazione, integrata ai dati del monitoraggio aerobiologico classico, analisi fenologiche e monitoraggio degli allergeni, costituirebbe un importante supporto nella pianificazione delle terapie per pazienti allergici.