. Confronto tra procedure di microiniezione 500 mm Microiniezione del gene di interesse inserito nel vettore nelle cellule polari Embrione precoce Cellule polari Uovo fertilizzato 50 mm Microiniezione del gene di interesse come DNA lineare nel pronucleo maschile embrione Si introducono embrioni micro-iniettati in madri adottive pseudo-gravide Nelle cellule somatiche delle progenie può essere evidente il DNA inserito ( se per esempio è un gene per il colore del mantello) . Alcuni embrioni si svilupperanno e avranno nelle loro cellule germinali il gene di interesse Drosophile TRANSGENICHE che avranno una singola copia del gene di interesse inserita in un cromosoma Tutte le Drosophile saranno incrociate per verificare la presenza del gene di interesse È necessario un ulteriore incrocio per identificare i topi in cui il DNA si è inserito nella linea germinale e può quindi essere trasmesso a tutta la progenie stabilmente TOPI TRANSGENICI che avranno copie in tandem del gene inserite a caso in un cromosoma

Dopo un incrocio si ottiene il topo fondatore Uso delle cellule embrionali staminali (ES) per ottenere topi transgenici Trasformazione delle cellule ES con DNA da inserire Cellule ES Cellule ES trasformate con DNA di interesse e controllate per PCR o per Southern per verificare l’inserimento (si possono anche SELEZIONARE le cellule con il costrutto di interesse) Prelievo di cellule embrionali staminali da una blastocisti di topo Inserimento di cellule ES trasformate in una blastocisti Progenie chimerica Dopo un incrocio si ottiene il topo fondatore Impianto in una madre pseudogravida Un vantaggio di questo sistema è che inserendo come marcatore selezionabile il gene neoR insieme al gene da inserire, si possono selezionare direttamente le cellule ES che hanno integrato il DNA esogeno, facendole crescere su terreno con G418

Knock out di geni di topo Una delle applicazioni più frequenti della produzione di topi transgenici sono gli studi di GENOMICA FUNZIONALE -> l’identificazione della funzione di una sequenza di DNA mediante disattivazione del gene a funzione non nota ed analisi del fenotipo Cellule staminali con il gene non funzionale (una copia) e derivanti da topi con il colore NERO del mantello Embrione derivante da un topo con il colore bianco del pelo Gene di interesse ingegnerizzato neoR Inserimento in cellule ES Impianto in una madre adottiva con pelo bianco Cellule con il gene alterato gene normale P gene normale neoR Appaiamento e crossing over RICOMBINAZIONE OMOLOGA Progenie chimerica, le parti che si sono sviluppate dalle cellule staminali sono nere P neoR Il gene inserito nelle cellule ES non è più funzionale L’incrocio delle chimere con omozigoti bianchi produce i topi fondatori, questi topi sono ETEROZIGOTI per il gene non funzionale. Incrociando gli eterozigoti tra loro si ottengono omozigoti per il gene mutato e si controlla il genotipo