CIBIO, Università di Trento (TN) Filippo Pacchioni Olivier Jousson CIBIO, Università di Trento (TN) Sviluppo di metodiche molecolari avanzate per il controllo di qualità microbiologico nei processi di produzione di prodotti farmaceutici e di integratori alimentari Progetto sostenuto nell’ambito del bando per progetti di ricerca scientifica finalizzati allo sviluppo di iniziative imprenditoriali (2014/2015)

I PARTNER E LE COLLABORAZIONI BANDO SVILUPPO ECONOMICO I PARTNER E LE COLLABORAZIONI CIBIO, Università di Trento (Povo, TN): Olivier Jousson (responsabile del laboratorio di Genomica Microbica) Elisabetta Giacobazzi Clotilde Bettua Paolo Struffi Mattia Benedet Filippo Pacchioni E Pharma Trento S.P.A. (Ravina, TN): Paolo Andreatta (ex Direttore Generale e Amministratore Delegato) Claudia Lunelli (responsabile laboratorio Microbiologico del controllo qualità) Mara Giacomozzi (responsabile del Controllo Qualità)

LA RICERCA Obiettivo del progetto: BANDO SVILUPPO ECONOMICO LA RICERCA Obiettivo del progetto: Implementare l’uso di metodologie molecolari (real-time PCR) alternative o complementari alle metodiche attualmente in uso per il controllo qualità microbiologico: nei processi produttivi in ambito farmaceutico nel monitoraggio degli ambienti di produzione e confezionamento Caratterizzazione della comunità batterica che popola l’impianto idrico e l’aria degli ambienti di lavoro dell’azienda con l’impiego della tecnologia NGS (Next Generation Sequencing)

CONTROLLO QUALITA’ MICROBIOLOGICO: ANALISI EFFETTUATE DALL’AZIENDA BANDO SVILUPPO ECONOMICO CONTROLLO QUALITA’ MICROBIOLOGICO: ANALISI EFFETTUATE DALL’AZIENDA Materie prime e prodotti finiti Conta totale dei microrganismi aerobi vivi Microrganismi specifici TAMC (conta totale microbica aerobica) TYMC (conta totale lieviti e muffe) Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus

CONTROLLO QUALITÀ MICROBIOLOGICO: ANALISI EFFETTUATE DALL’AZIENDA BANDO SVILUPPO ECONOMICO CONTROLLO QUALITÀ MICROBIOLOGICO: ANALISI EFFETTUATE DALL’AZIENDA Acqua purificata ad osmosi inversa TAMC (conta totale microbica aerobica) Ambienti di produzione e confezionamento TYMC (conta totale lieviti e muffe) Aria degli ambienti di lavoro (aree produttive, magazzino, aree laboratorio microbiologico)

BANDO SVILUPPO ECONOMICO CONTROLLO QUALITÀ MICROBIOLOGICO: METODO COLTURALE (linee guida ‘European Pharmacopoeia’) Pesare e risospendere la materia prima/prodotto finito Filtrare il campione Posizionare il filtro sul terreno di crescita Incubare i terreni a crescere Contare le colonie cresciute Raccogliere il campione d’acqua lungo l’impianto e filtrarlo Aspirare il campione d’aria nei locali dell’azienda Incubare i terreni a crescere Contare le colonie cresciute

METODO COLTURALE: TEMPI E CONDIZIONI DI CRESCITA BANDO SVILUPPO ECONOMICO METODO COLTURALE: TEMPI E CONDIZIONI DI CRESCITA Microrganismo Terreno Temperatura Tempi di incubazione Materie prime e prodotti finiti TAMC TSA 30 – 35 °C 3-5 giorni TYMC SDA 20 – 25 °C 5 giorni Bile-tolerant gram-negative bacteria VRBGA 18 – 24 h Escherichia coli MCA 18 – 72 h Salmonella enterica XLDA 18 – 48 h Pseudomonas aeruginosa Cetrimide agar Staphylococcus aureus Mannitolo agar Ambienti di produzione e confezionamento R2A 7 giorni

LIMITI METODO COLTURALE: TEMPO E TERRENO DI COLTURA BANDO SVILUPPO ECONOMICO LIMITI METODO COLTURALE: TEMPO E TERRENO DI COLTURA Maggiori tempi di stoccaggio dei prodotti finiti Tempi di risposta delle analisi lunghi (dai 3 ai 7 giorni) Si allungano tempi di rilascio e consegna dei prodotti finiti Saturazione dei magazzini Maggiori tempi prima dell’utilizzo delle materie prime Selezione di alcune specie a scapito di altre più difficilmente coltivabili o presenti in minore quantità in seguito alla scelta di: terreno di coltura condizioni di crescita

ANALISI MOLECOLARE DI PRODOTTI FARMACEUTICI BANDO SVILUPPO ECONOMICO ANALISI MOLECOLARE DI PRODOTTI FARMACEUTICI - Impiego della real-time PCR per la rilevazione del numero di copie del gene 16S batterico - Vantaggi: Tempi più brevi per il controllo qualità microbiologico Risposte più specifiche: possibilità di sviluppare saggi batterio-specifici, utile per specie batteriche patogene

ANALISI MOLECOLARE: SVANTAGGIO BANDO SVILUPPO ECONOMICO ANALISI MOLECOLARE: SVANTAGGIO Utilizzo di intercalanti vitali che legano il DNA delle cellule morte distinguendo organismi vivi dai morti Impossibilità di distinguere microrganismi vivi da quelli morti DNA di una cellula morta legato al PMA e non amplificato dalla PCR Cellula Morta Cellula Viva PMA/Luce qPCR Propidium Monoazide (PMA)

Punti critici dell’analisi molecolare BANDO SVILUPPO ECONOMICO Punti critici dell’analisi molecolare Assenza kit specifico per estrarre DNA da matrici farmaceutiche Complessità nella composizione delle matrici farmaceutiche Bassa carica batterica nelle materie prime e prodotti finiti Discriminare DNA vivo da quello morto Testata l’efficienza di estrazione di 4 kit diversi Ottimizzare protocollo di estrazione per bloccare potenziali inibitori dell’estrazione Aumentare massa di partenza per l’estrazione Saggio PMA

ANALISI MATERIE PRIME E PRODOTTI FINITI: METODO MOLECOLARE BANDO SVILUPPO ECONOMICO ANALISI MATERIE PRIME E PRODOTTI FINITI: METODO MOLECOLARE Pesare 1g di Proxerex Sciogliere la matrice in 10mL di tampone peptonato a pH 7,0 sterile Analisi copie 16S 250µl senza PMA 250µl + 1,25µl PMA (50µm) Bioshake, 1000rpm, 20min, 25°C Cambiare tubo Cross-linking Centrifugare 10min a 20Kxg e scartare 200µl Estrazione con PowerSoil, protocollo ‘LowBiomass’ (aggiungendo 4-µL IEC) 16S qPCR

ANALISI MATERIE PRIME E PRODOTTI FINITI: ULTIMI ASPETTI DA OTTIMIZZARE BANDO SVILUPPO ECONOMICO ANALISI MATERIE PRIME E PRODOTTI FINITI: ULTIMI ASPETTI DA OTTIMIZZARE Aumentare la quantità di materiale di partenza da estrarre Concentrare la materia prima o il prodotto finito su filtri 0,22μm Ottimizzare il saggio di vitalità con coloranti vitali su filtro (PMA) Volume di partenza troppo basso per le matrici con cariche batteriche basse Estrazione con PowerWater, MoBio CFU Metodo colturale Copie 16S Metodo molecolare

BANDO SVILUPPO ECONOMICO CARATTERIZZAZZIONE DELLA COMUNITÀ MICROBICA DELL’IMPIANTO IDRICO E DELLE AREE AZIENDALI Raccogliere il campione d’acqua lungo l’impianto e filtrarlo Estrazione del DNA batterico Amplificazione e sequenziamento del gene 16S Analisi bioinformatiche delle sequenze Aspirare il campione d’aria nei locali dell’azienda

IMPIANTO IDRICO E-PHARMA BANDO SVILUPPO ECONOMICO IMPIANTO IDRICO E-PHARMA LINEA 1 LINEA 6 PW-30 LINEA 2 LINEA 7 LINEA 3,4,5 LINEA 8 3° Piano Sistemare colore linea con il grafico della slide 17 PW-22 PW-23 PW-27 PW-11 PW-12 PW-13 PW-19 PW-20 PW-14 2° Piano PW-10 PW-9 PW-3 PW-2 PW-6 PW-5 PW-4 1° Piano

BANDO SVILUPPO ECONOMICO CARATTERIZZAZIONE DELLA COMUNITÀ MICROBICA DELL’IMPIANTO IDRICO AZIENDALE MDS/PCoA sulla distanza UniFrac pesata Linea Asse 2 [14,8%] Devo sistemare la slide. Sanificazione Prima Dopo Asse 1 [34,7%]

BANDO SVILUPPO ECONOMICO IMPATTO DELLA SANIFICAZIONE DELL’IMPIANTO SUI PRINCIPALI PHYLA BATTERICI Phyla principali Sanificazione Abbondanza relativa media Dopo Prima Sistemare colore legenda * = batteri sporigeni *

Stesura protocollo molecolare BANDO SVILUPPO ECONOMICO RICADUTE SUL TERRITORIO Analisi controllo qualità eseguite in tempi più brevi Vantaggi qualitativi, logistici ed economici per E-Pharma ed altre realtà produttive nel territorio Stesura protocollo molecolare DISSEMINAZIONE DEI RISULTATI Comunità microbica dell’impianto idrico Oggetto di una possibile pubblicazione sulla caratterizzazione della comunità microbica degli ambienti di lavoro Comunità microbica dell’aria di reparti aziendali LAVORI SUCCESSIVI AL PROGETTO Inserimento e validazione dei protocolli impostati durante il progetto nel processo di controllo qualità microbiologico, in parallelo oppure sostituiti alle metodiche tradizionali previa presentazione di domanda di variazione e accettazione da parte del Ministero della Salute.