Il dogma centrale della Biologia molecolare Cellula DNA mRNA Trascrizione Trascrizione inversa Polipeptide (proteina) Traduzione Ribosoma

ESPRESSIONE DEL GENOMA L’Espressione del genoma è specifica del tipo di cellula e del suo stato. Essa richiede la sintesi di molecole di RNA (trascrizione) che eventualmente dirigeranno la sintesi di proteine (traduzione). l’RNA polimerasi non ha bisogno di un primer ma l’inizio avviene sole su certe sequenze l’RNA sintetizzato non rimane appaiato allo stampo + enzimi possono trascrivere lo stesso gene contemporaneamente

ESPRESSIONE DEL GENOMA la trascrizione è meno accurata della replicazione (1mismatch/1000 nt, assenza di meccanismi di riparazione). Ogni errore che insorge durante la replicazione può essere catastrofico e diventa permanente nel genoma di quell’individuo e può essere trasmesso alla progenie La trascrizione produce solo copie transienti di ciascuna regione e danneggia solo un singolo trascritto tra i diversi che sono prodotti La trascrizione copia solo alcune porzioni del genoma e produce anche mille copie di ciascuna regione La replicazione deve copiare tutto il genoma una sola volta

……… RNA polimerasi DNA dipendente IL PROTAGONISTA PRINCIPALE DELLA TRASCRIZIONE E’ L’ENZIMA……. ……… RNA polimerasi DNA dipendente La struttura 3D dell’RNA polimerasi ricorda una chela

La scelta della regione da trascrivere e……………… ………..in quale quantità è un processo altamente regolato una cellula batterica trascrive un gruppo diverso di geni a seconda del terreno di cultura in cui sta crescendo una cellula muscolare e un neurone trascrivono gruppi diversi di geni (differenziamento cellulare)

Ciascuna regione contiene uno o più geni LA SCELTA DELLA REGIONE DA TRASCRIVERE NON È CASUALE Ciascuna regione contiene uno o più geni Appositi segnali sul DNA indicano alla RNA Polimerasi dove cominciare e dove finire Ci sono sequenze di DNA che dirigono l’avvio della trascrizione Ci sono sequenze di DNA che decretano il termine della trascrizione PROMOTORE sequenza di nucleotidi che indica il punto di INIZIO TERMINATORE sequenza di nucleotidi che indica il punto di TERMINE 7

IL PROMOTORE BATTERICO È Si definisce UNITÀ DI TRASCRIZIONE il tratto di DNA compreso fra il sito di inizio e quello di termine per l’RNA Polimerasi Può, nei procarioti, comprendere più di un gene Il sito di inizio indica la posizione sul DNA corrispondente alla prima base incorporata nell’RNA Il termine A MONTE identifica sequenze che precedono l’unità di trascrizione IL PROMOTORE BATTERICO È A MONTE DELL’UNITÀ DI TRASCRIZIONE Il termine A VALLE identifica sequenze nella stessa direzione dell’espressione IL TERMINATORE È A VALLE DEL CODONE DI INIZIO 8

SEQUENZE CONSERVATE Una sequenza conservata è la sequenza che rappresenta le basi più spesso trovate in una data successione ed in una particolare posizione dove successione e posizione non sono casuali. Tale sequenza può essere definita come una sequenza consenso Una sequenza consenso è dedotta dall’allineamento di tutti gli esempi noti. Una sequenza consenso può essere definito come un putativo sito di riconoscimento sul DNA

PROMOTORE Un promotore è definito dalla presenza di sequenze consenso in una localizzazione specifica. INSIEME DEI SEGNALI MOLECOLARI PRESENTI SUL DNA RICONOSCIUTI DALL’RNA POLIMERSI

PROMOTORE La regione -35 La regione -10 La distanza che separa le regioni -35 e -10 Start point 11

Startpoint Lo startpoint (+1) è di solito (>90% delle volte) una purina. Spesso è la base centrale della sequenza CAT, ma la conservazione della tripletta non è frequente

La sequenza -10 regione di 6 bp riconoscibile in quasi tutti i promotori. Il centro dell’esamero è generalmente circa 10 bp a monte dello startpoint, ma la distanza varia da -18 a -9. L’esamero è spesso chiamato Pribnow box.

Pribnow box Il consenso è TATAAT, e può essere indicato nella forma dove il pedice indica la percentuale dell’occorrenza della base più comune, che varia dal 45 al 96%. La basi più importanti sembrano essere le più conservate: la TA iniziale e la T finale.

La sequenza -35 Un altro esamero conservato è centrato ~35 bp a monte dello startpoint. È chiamata la sequenza -35. Il consenso è TTGACA in forma più dettagliata T82T84G78A65C54A45

Distanza –10 / -35 la distanza è critica. La distanza che separa i siti –35 e –10 è tra 16-18 bp nel 90% dei promotori La sequenza nella regione non è importante, ma la distanza è critica.

Orientazione della RNA pol I promotori sono vettoriali e indicano quale dei due filamenti deve essere usato come stampo

ELEMENTI A MONTE DELLA REGIONE - 35 Siti Fis UP Molti promotori possiedono altre sequenze “consenso” poste a monte della sequenza -35 (elementi UP e siti FIS) Elementi presenti in promotori di geni la cui espressione è altamente regolata (promotori ribosomali) Sito di legame x proteine in grado di regolare l’ espressione genica PROMOTORE ESSENZIALE (minimo) Elemento Up 18

Nucleoside trifosfato + RNAn ⇄ RNAn+1 + pirofosfato IL PROTAGONISTA PRINCIPALE DELLA TRASCRIZIONE E’ L’ENZIMA……. ……… RNA polimerasi DNA dipendente L'RNA polimerasi (DNA-dipendente) è un’enzima appartenente alla classe delle transferasi che catalizza la seguente reazione: Nucleoside trifosfato + RNAn ⇄ RNAn+1 + pirofosfato

I Batteri posseggono una RNA polimerasi • relativamente semplice Le RNA Polimerasi I Batteri posseggono una RNA polimerasi • relativamente semplice 􀂾 Gli Archaea posseggono una RNA polimerasi …….ma • è più complessa • ha caratteristiche funzionali simili a quelle degli Eucaria 􀂾gli Eucaroti hanno tre RNA polimerasi • Pol I : RNA ribosomali • Pol II : RNA messaggeri • Pol III: tRNA e piccoli RNA Nella cellula eucariotica esistono altre RNA polimerasi : l’RNA polimerasi mitocondriale e l’RNA polimerasi dei cloroplasti

LE RNA POLIMERASI EUCARIOTICHE La RNA Pol I, localizzata nel nucleolo, trascrive il gene per il precursore degli RNA ribosomiali (40% dei trascritti totali) La RNA Pol II è responsabile della trascrizione della maggior parte dei geni, inclusi quelli codificanti proteine, e alcuni piccoli RNA nucleari (U1, U2, U4, U5) La RNA Pol III trascrive i geni per i tRNA, alcuni piccoli RNA nucleari (es. U6) e l’RNA ribosomiale 5S

RNA polimerasi di E.coli è un’enzima costituito da piu’ subunità oloenzima β (155 kD) β’ (160 kD) costituiscono il core catalitico La subunità α (40 kD) è richiesta per l’assemblaggio del core dell’enzima, per il riconoscimento del promotore e per l’interazione con effettori (attivatori o repressori). La subunità σ (32-90 kD) Esistono diversi tipi di σ specifiche per gruppi diversi di geni da trascrivere La presenza di σ fa aumentare l’affinità dell’enzima x il DNA La subunità ω contribuisce alla stabilità del complesso proteico. 22

Interagisce con la subunità α della RNA polimerasi. SUBUNITÀ alpha La subunità alpha mediante il dominio C terminale riconosce e lega l’elemento UP e questo determina un legame molto stretto tra polimerasi e promotore ELEMENTO UP Sequenza ricca di A-T. Interagisce con la subunità α della RNA polimerasi. Si trova tipicamente nei promotori che sono molto espressi, quali quelli dei geni per gli rRNA.

SUBUNITÀ sigma SIGMA CONTROLLA IL RICONOSCIMENTO DEL PROMOTORE La subunità sigma contiene regioni che riconoscono in modo specifico gli elementi a -35 e a -10 L’  elica coinvolta nel riconoscimento della regione -10 interagisce con le basi del filamento non stampo in maniera da stabilizzare il DNA aperto due  eliche della regione 4 di sigma prendono contatto con la regione -35 mediante un dominio di legame al DNA helix-turn-helix solco maggiore 24

Fattori σ I promotori hanno tutti la stessa dimensione e localizzazione relativa allo start-point, ed hanno sequenze conservate (–35 e –10). MA Esistono promotori con differenti sequenze consensus E. coli ha diversi fattori sigma che riconoscono promotori con differenti consensus L’espressione di differenti fattori sigma è indotta da differenti condizioni ambientali

La reazione di trascrizione ha tre passaggi La sintesi dell’RNA, come quasi tutte le reazioni biologiche di polimerizzazione, avviene in tre fasi: Inizio Allungamento Termine 26

L’INIZIO DELLA TRASCRIZIONE LA RNA POLIMERASI NON RICHIEDE UN PRIMER La trascrizione non richiede l’intervento di un primer, ma è necessaria una interazione molto specifica con il ribonucleotide di inizio, che normalmente è una A. a) l’oloenzima si lega debolmente al DNA più volte alla ricerca di un promotore b) l’oloenzima ha trovato un promotore e si lega debolmente ad esso a formare un complesso chiuso c) l’oloenzima si è legato saldamente al DNA denaturandone localmente i due filamenti e formando un complesso aperto (bolla di trascrizione) 27

Affinità dell’RNA pol al DNA Il nucleo (core) dell’RNA polimerasi ha un’affinità intrinseca per il DNA basata su interazioni fra l’enzima (basico) e il DNA (acido) e si lega stabilmente a siti di legame aspecifici sul DNA. L’associazione del core al fattore sigma rende molto labile il legame a siti aspecifici e consente all’enzima di riconoscere siti specifici con elevata affinità

La sintesi procede in direzione 5’ 3’ L’RNA POLIMERASI CIRCONDA LA BOLLA L’RNA Polimerasi, quando si lega al promotore, separa i due filamenti del DNA in una “BOLLA” transitoria e utilizza uno dei filamenti come stampo per dirigere la sintesi di una sequenza complementare di RNA I processi di appaiamento e aggiunta delle basi avvengono all’interno della bolla La sintesi procede in direzione 5’ 3’ Il 3’OH dell’RNA nascente forma il legame fosfodiestereo con il nucleoside 5’ trifosfato in arrivo allungando la catena. 29

L’ENZIMA SVOLGE E RIAVVOLGE IL DNA L’ENZIMA SINTETIZZA L’RNA LA TRASCRIZIONE AVVIENE PER APPAIAMENTO DELLE BASI ALL’INTERNO DELLA ”BOLLA” DI DNA NON APPAIATO DURANTE LA TRASCRIZIONE LA BOLLA SI MANTIENE ALL’INTERNO DELL’RNA POLIMERASI L’ENZIMA SVOLGE E RIAVVOLGE IL DNA L’ENZIMA SINTETIZZA L’RNA La bolla si sposta insieme all’RNA polimerasi man mano che l’enzima si muove lungo il DNA e la catena dell’RNA si allunga La lunghezza della bolla è di circa 12-14 bp e la lunghezza dell’ibrido DNA-RNA al suo interno è di circa 8-9 bp 30

LA BOLLA DI TRASCRIZIONE SI SPOSTA LUNGO IL DNA I processi di appaiamento e aggiunta delle basi avvengono all’interno della bolla e sono catalizzati e controllati dall’enzima La sintesi dell’RNA parte dall’estremità 5’ e procede in direzione dell’estremità 3’ Il gruppo 3’OH dell’ultimo nucleotide aggiunto alla catena reagisce con il nucleotide 5’ trifosfato in arrivo che si aggiunge alla catena.

IL SITO ATTIVO CONTIENE LA BOLLA DI TRASCRIZIONE Una parete proteica costringe il DNA a curvarsi all’interno del sito attivo della RNA polimerasi

LA RNA POLIMERASI MANTIENE APERTO IL DNA 33

1) La RNA polimerasi si lega al DNA in un complesso chiuso L’INIZIO DELLA TRASCRIZIONE Comprende più fasi 1) La RNA polimerasi si lega al DNA in un complesso chiuso 2) Il complesso chiuso si converte nel complesso aperto Trascritti abortivi 3) La polimerasi incorpora i primi 9 o 10 nucleotidi nella catena nascente di DNA 4) La polimerasi rilascia il suo fattore sigma e comincia la fase di allungamento 34

TRASCRITTI ABORTIVI Dopo l’ingresso del ribonucleotide di inizio nel sito attivo, segue una fase denominata inizio abortivo, nella quale la polimerasi sintetizza brevi frammenti di RNA (<10 nt) che vengono rilasciati senza che la polimerasi si dissoci dallo stampo, sul quale inizia poi la sintesi di un nuovo frammento. La regione 3.2 di sigma ostruisce il canale di uscita dell’ RNA 35

Il ciclo di σ Appena la RNA polimerasi, oloenzima, ha superato la fase abortiva e inizia a spostarsi lungo lo stampo allungando l’RNA, si dissocia il fattore σ che raggiunge il core di una nuova polimerasi per iniziare la sintesi di un nuovo RNA

ESPRESSIONE DEL GENOMA Molte copie di RNA possono essere prodotte a partire da un singolo gene poichè l’RNA sintetizzato non rimane appaiato allo stampo e più molecole di RNA polimerasi possono trascriverlo in un determinato momento. estremità 5’del gene estremità 3’del gene I trascritti all’estremità 3’ del gene sono più lunghi poichè la direzione della trascrizione è da sinistra a destra. FORZA DI UN PROMOTORE Per forza di un promotore s’intende il numero di trascritti a cui esso può dare inizio in un dato tempo. La forza di un promotore è collegata alla affinità di legame con la polimerasi ed alla capacità di evadere dal promotore

Gli attivatori e i repressori sono proteine in grado di legarsi al DNA I MODULATORI TRASCRIZIONALI I batteri devono rispondere repentinamente ai cambiamenti delle condizioni ambientali per cui l’attivita’ trascrizionale deve essere velocemente attivata o repressa L’espressione genica e’ regolata da proteine regolative che possono attivare o reprimere la trascrizione (attivatori o repressori) Gli attivatori e i repressori sono proteine in grado di legarsi al DNA

GLI ATTIVATORI AGISCONO SECONDO DUE MODALITA’: INTERAZIONE PROTEINA-PROTEINA CLASSE I Si legano a monte della -35 e ancorano la RNAP interagendo con il dominio α-CTD facilitando il riconoscimento del promotore da parte dell’enzima CLASSE II Si legano sempre a monte della – 35 ma interagiscono con la subunità σ dell’enzima

GLI ATTIVATORI AGISCONO SECONDO DUE MODALITA’: VARIAZIONE CONFORMAZIONALE Legano il promotore tra la regione -10 e -35 facilitando il riconoscimento del promotore da parte dell’RNA pol

I REPRESSORI AGISCONO SECONDO TRE MODALITA’: Ingombro sterico Il repressore lega la regione compresa tra le sequenze - 10 e - 35 impedendo il riconoscimento del promotore Inducendo la formazione di un loop Più molecole di repressore legano il DNA ( in regioni anche lontane dal promotore) interagiscono tra di loro impedendo il legame dell’RNA pol con la regione del promotore

I REPRESSORI AGISCONO SECONDO TRE MODALITA’: Per modulazione di un attivatore Il repressore lega l’attivatore impedendone l’interazione con la RNA pol

CARATTERISTICHE GENERALI DELLE RNA POLIMERASI Sintetizza RNA in direzione 5’ 3’ Si muove srotolando l’elica del DNA (Elicasi + Topoisomerasi) Non necessita di un primer ma l’inizio avviene solo su specifiche regioni (promotori) attività primasica Aggiunge nucleotidi usando un filamento di stampo Utilizza ribonucleosidi 5’-trifosfato (ATP, GTP, UTP e CTP) e richiede Mg++ Una finestra di 9 nt DNA-RNA si muove lungo il DNA Ogni nucleotide è selezionato in base alle regole della complementarietà A:U e G:C e alla geometria della coppia di basi b=blue b’ = viola a = giallo e verde

ALLUNGAMENTO è il passaggio nella reazione di sintesi della macromolecola quando la catena nucleotidica si allunga per l’aggiunta di subunità. Dopo diversi tentativi, quando la RNA polimerasi riesce a sintetizzare un frammento più lungo di 10 nt, inizia la fase di allungamento e si ha poi il distacco del fattore . L’allungamento è catalizzato dal core enzimatico e procede alla max velocità di 40 basi/sec. L’allungamento si arresta in presenza del nucleotide scorretto.

I terminatori batterici sono di due tipi: TERMINE DELLA TRASCRIZIONE è il passaggio che termina la sintesi della macromolecola bloccando l’addizione delle subunità, e generalmente causando la dissoluzione dell’apparato di sintesi Tutte le sequenze necessarie per la terminazione sono nella regione trascritta Alcune sequenze, dette terminatori inducono il rilascio della RNA polimerasi e del trascritto. La trascrizione termina ed il core enzimatico si dissocia dal DNA in corrispondenza dei terminatori I terminatori batterici sono di due tipi: rho-indipendenti, e rho-dipendenti. 45

Formazione di un RNA hairpin

TERMINAZIONE DELLA TRASCRIZIONE I terminatori batterici sono di due tipi: i) rho-indipendenti, e ii) rho-dipendenti. I terminatori rho-indipendenti, detti anche terminatori intrinseci, sono costituiti da una corta sequenza palindromica (ca. 20 nt) cui segue una sequenza di 8 coppie A:T. Il terminatore è una struttura a forcina seguita da una serie di residui U. In genere vi è una regione ricca di GC nei pressi della base dello stelo. La delezione dei residui U all’estremità 3’ non provoca più la fine della trascrizione

Viene aperto a forza il canale di uscita dell’RNA? L’interferenza provocata dalla struttura stem-loop unita alla debolezza del legame A:U favorisce il distacco del trascritto dallo stampo. La struttura stem-loop assunta dall’RNA provoca la rottura del complesso di allungamento Viene aperto a forza il canale di uscita dell’RNA? Si interrompono le interazioni tra l’RNA e lo stampo?

La proteina Rho La proteina Rho, è una proteina essenziale per E.coli. Ha una struttura omoesamerica (monomero di 46 kDa) e assume una forma ad anello, contiene un dominio di legame al ssRNA e un dominio di legame all’ATP. Si lega all’RNA nascente ed ha attività elicasica.

La terminazione non può avvenire se rut viene tradotto La terminazione Rho-dipendente (1/3) Nel secondo caso la terminazione richiede il fattore proteico rho (che lega siti specifici detti rut). Rho Utilization Site La terminazione non può avvenire se rut viene tradotto Proteina Rho lega il sito rut sull’mRNA e si sposta lungo il messaggero inseguendo la RNA polimerasi Ribosoma

La terminazione Rho-dipendente (2/3) Il movimento di Rho richiede l’idrolisi dell’ATP La RNA polimerasi si ferma su un terminatore; Rho raggiunge la polimerasi.

La terminazione Rho-dipendente (3/3) L’attività elicasica di rho causa la dissociazione dell’ibrido RNA-DNA e richiede ATP.

Molte copie di RNA possono essere prodotte a partire da un singolo gene poichè più molecole di RNA polimerasi possono trascriverlo in un determinato momento. I trascritti all’estremità 3’ del gene sono più lunghi poichè la direzione della trascrizione è da sinistra a destra. estremità 5’del gene estremità 3’del gene

RNA Polimerasi La RNA Polimerasi svolge le seguenti funzioni: Riconoscimento della regione promotrice Svolgimento della doppia elica del DNA (Elicasi + Topoisomerasi) RNA Priming (Primasi) RNA Polimerizzazione Riconoscimento del terminatore