Microfertilizzazione assistita Scuola di Specializzazione in Fisiopatologia della Riproduzione degli Animali Domestici Microfertilizzazione assistita Corso di Biotecnologie della Riproduzione Animale Prof.ssa M.E. Dell’Aquila Micromanipolatore ICSI AA 2016/17
Sommario (1) Introduzione Notizie storiche Tecniche di perforazione della Zona Pellucida Tecniche di introduzione artificiale del seme nell’ovocita
Sommario (2) Preparazione dell’ovocita e del seme per l’ICSI Procedura di ICSI ICSI in medicina riproduttiva umana ICSI in specie di interesse zootecnico ICSI per la ricerca sul processo fecondativo
Notizie storiche Keefer & Brackett, 1987 Palermo et al., 1992 Van Steirteghem et al., 1993
Stazione di micromanipolazione
Tecniche di perforazione della Zona Pellucida ZD= zona drilling ZT= zona thinning PZD= partial zona dissection PZR= partial zona removal
Tecniche di introduzione artificiale del seme nell’ovocita SUZI= subzonal sperm injection ICSI= intracytoplasmic sperm injection
SCHEMA
Preparazione degli ovociti e degli spematozoi per l’ICSI Preparazione ovociti - rimozione cellule cumulo ooforo (80 UI/ml ialuronidasi in IVM medium) - selezione morfologica (PB, ZP, spazio perivitellino, citoplasma) Preparazione spermatozoi - lavaggi (Tyr-HEPES; EBSS) - riduzione della motilità (+10% PVP)
Allestimento della piastra di ICSI Microgoccia di HTF con ovocita Microgoccia di EBSS 10% PVP con seme Striscia di seme per la messa a fuoco del fondo della piastra Piastra petri 60 mm Ø
Procedura di ICSI Immobilizzazione ed aspirazione dello spermatozoo Orientazione dell’ovocita Avvicinamento dello spermatozoo all’estremità della pipetta di iniezione Perforazione delle membrane ovocitarie Aspirazione di parte del citoplasma della cellula uovo nella pipetta di iniezione Rilascio dello spermatozoo nel citoplasma Rilascio dell’ovocita-passaggio nel mezzo di coltura
Problemi Eccessiva suzione di citoplasma Eccessivo rilascio di medium Difficoltosa perforazione membrane ovocita Difficoltoso rilascio dello spermatozoo Alterazioni nel rilascio del calcio intracellulare
ICSI in medicina riproduttiva umana ICSI con: Very Few Sperm Cells Sperm Head Immotile Sperm Dead Sperm Grossly Defective Sperm Cells Round/Elongated Spermatids
ICSI in specie di interesse zootecnico Usata nelle specie nelle quali la fertilizzazione in vitro con tecnica convenzionale non consegue risultati buoni e riproducibili Si può effettuare con spermatozoi presessati
ICSI per la ricerca sul processo fecondativo Sistema di utilità unica per indagini sulla sequenza di eventi di interazione tra ovocita e spermatozoo Microscopia CLSM
Letture consigliate Transgenic Animal Technology (cap 20) Dell’Aquila et al., Hum Reprod 1997