PCR - REAZIONE a CATENA della POLIMERASI E’ “IL” mezzo per produrre in vitro grandi quantità di una specifica sequenza di DNA, partendo da DNA estremamente complesso. Primer a RNA Nuovo filamento DNA polimerasi DNA stampo Primers a RNA Il principio a cui si ispira la PCR è la replicazione del DNA: REPLICAZIONE 5’ 3’ Primer oligonucleotidico DNA polimerasi termostabile PCR 1 1 x 109 DNA

Polymerase chain reaction (PCR) PCR = Reazione a catena catalizzata dalla DNA polimerasi Amplificazione selettiva di una ben precisa regione di DNA compresa tra due sequenze specifiche Metodologia caratterizzata da una enorme sensibilità e da un’alta specificità La DNA polimerasi può essere indirizzata a sintetizzare una regione specifica del DNA delimitandone in modo opportuno le estremità

La PCR sfrutta alcune caratteristiche peculiari della duplicazione del DNA: in vivo la DNA polimerasi impiega un DNA a singolo filamento come stampo per la sintesi di una nuova elica complementare in vitro un DNA a singolo filamento può essere prodotto per riscaldamento del DNA a doppia elica a temperature relativamente elevate (65°C ed oltre) in vivo la DNA polimerasi necessita di una piccola sequenza di DNA a doppia elica (primer/innesco) per “innescare” la sintesi in vitro il punto di inizio della sintesi di DNA è specificato utilizzando come innesco un oligonucleotide opportuno (primer) in grado di appaiare il filamento-stampo nel punto desiderato.

I primer per la DNA polimerasi Aggiungendo un primer oligonucleotidico specifico per ciascun filamento, entrambi i filamenti di DNA possono servire da stampo. 5’…CTGACACAACTGTGTTCACTAGCAA……………….…AAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTG…3’ 3’…GACTGTGTTGACACAAGTGATCGTT……………………TTCCACTTGCACCTACTTCAACCAC….5’ Riscaldamento 5’…CTGACACAACTGTGTTCACTAGCAA……………………AAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTG…3’ 3’…GACTGTGTTGACACAAGTGATCGTT……………………TTCCACTTGCACCTACTTCAACCAC.….5’ Separazione delle due eliche del DNA

Appaiamento dei primer 5’…CTGACACAACTGTGTTCACTAGCAA……………………………AAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTG…3’ 3’ CCACTTGCACCTACTTCAAC 5’ 3’…GACTGTGTTGACACAAGTGATCGTT……………………………TTCCACTTGCACCTACTTCAACCAC…5’ 5’ACACAACTGTGTTCACTAGC 3’ Inizio della sintesi 3’……TTCCACTTGCACCTACTTCAAC 5’ 5’ACACAACTGTGTTCACTAGCAA…… 3’ La DNA polimerasi impiega i primer per iniziare la sintesi in direzione 5’3’ dei nuovi filamenti complementari alle sequenze bersaglio del DNA.

I filamenti di DNA che vengono sintetizzati a partire da ciascun primer si estendono fino ad oltre la posizione riconosciuta dal primer del filamento opposto In ciascun filamento di nuova sintesi vengono a generarsi nuovi siti in cui può appaiarsi il primer.

AMPLIFICAZIONE DI UNA SPECIFICA REGIONE DI DNA Al termine di n cicli di PCR il risultato netto è una miscela di reazione contenente un numero massimo teorico di molecole di DNA a doppia elica pari a 2n DNA a doppio filamento che serve da stampo di partenza Primo ciclo di amplificazione Due molecole di DNA a doppia elica Secondo ciclo di amplificazione Quattro molecole di DNA a doppia elica AMPLIFICAZIONE DI UNA SPECIFICA REGIONE DI DNA

AMPLIFICAZIONE DI UNA SEQUENZA DI DNA i primers si estendono complementarietà al primer 1 complementarietà al primer 2 primer 1 5’ 3’ primer 2 i filamenti vengono separati ed i primers si appaiano regione di interesse I°step

AMPLIFICAZIONE DI UNA SEQUENZA DI DNA 3’ 5’ i filamenti vengono separati ed i primers si appaiano i primers si estendono filamenti di lunghezza omogenea filamenti di lunghezza variabile II°step

AMPLIFICAZIONE DI UNA SEQUENZA DI DNA 5’ 3’ complementarietà al primer 1 complementarietà al primer 2 i filamenti vengono separati ed i primers si appaiano i primers si estendono Frammenti desiderati (quelli di lunghezza variabile non sono mostrati) E così via III°step

COMPONENTI di una REAZIONE di PCR Stampo DNA a doppio filamento Deossiribonucleotidi trifosfati Miscela equimolare di dATP, dTTP, dGTP, dCTP Primers Oligonucleotidi complementari a regioni dei filamenti opposti che fiancheggiano la sequenza DNA bersaglio Tampone contenente cloruro di magnesio Lo ione Mg2+ è essenziale per il funzionamento dell’enzima Enzima Tradizionalmente viene usata la Taq polimerasi, enzima termostabile estratto dal batterio termofilo Thermus aquaticus dNTP Mg2+

Amplificazione di DNA con PCR La quantità di DNA richiesta per un esperimento di PCR è estremamente piccola (circa 1g di DNA genomico totale). In una provetta contenente il DNA si aggiungono: I due oligonucleotidi che servono da primer La Taq DNA polimerasi Una miscela dei quattro nucleotidi precursori

TAPPE DENATURAZIONE. La miscela di reazione è riscaldata a circa 94°C per separare la doppia elica ANNEALING. La temperatura viene abbassata per permettere ai primer di appaiarsi alle sequenze complementari presenti nelle molecole di DNA stampo

SINTESI. La temperatura viene portata. a 72°C e tenuta costante SINTESI. La temperatura viene portata a 72°C e tenuta costante per 5 min affinchè possa procedere la sintesi del DNA DENATURAZIONE. La temperatura viene nuovamente portata a 95°C per permettere una nuova denaturazione

il ciclo continua I primer si legano ai filamenti di DNA Denaturazione del DNA per separare i filamenti I primer si legano ai filamenti di DNA La Taq DNA polimerasi sintetizza nuovi filamenti di DNA Nuovo step di denaturazione

Scelta della temperatura di annealing La temperatura di appaiamento (annealing) è un parametro variabile capace di determinare la specificità di un esperimento di PCR. La scelata di tale temperatura è legata alla temperatura di fusione/dissociazione (Tm) del DNA da amplificare. Temperatura di fusione/dissociazione (Tm) La Tm di un filamento di DNA è definita come la temperatura alla quale il 50% del DNA è presente come singolo filamento La temperatura di annealing in un esperimento di PCR viene di solito fissata ad un valore inferiore di 10°C rispetto alla Tm degli oligonucleotidi scelti come primer

Taq DNA polimerasi La DNA polimerasi comunemente usata negli esperimenti di PCR è purificata dal batterio termofilo Thermophilus aquaticus ed è un enzima altamente termostabile che prende il nome di Taq polimerasi. Il batterio Thermophilus aquaticus vive ad una temperatura di circa 75°C. La Taq polimerasi non viene denaturata dalle alte temperature e quindi può essere usata negli esperimenti di PCR non essendo degradata durante i cicli di reazione. La possibilità di utilizzare cicli di reazione a temperature elevate aumenta la specificità della PCR diminuendo le interazioni aspecifiche tra i primer ed i filamenti di DNA

Amplificazione di una sequenza di DNA aspecifica indesiderata Un appaiamento erroneo dei primer (mismatch) può produrre un’efficiente amplificazione di sequenze aspecifiche indesiderate

Amplificazione di una sequenza di DNA aspecifica indesiderata a) I primer oligonucleotidici possono appaiarsi con sequenze che differiscono leggermente dalle sequenze bersaglio b) La DNA polimerasi impiegherà questi primer appaiati erroneamente per sintetizzare un filamento complementare a una sequenza indesiderata in direzione 3’ rispetto al primer c) Il primo appaiamento erroneo produrrà un filamento di DNA di lunghezza indefinita che conterrà il primo primer incorporato nell’ estremità 5’

d/e) Un appaiamento erroneo del secondo primer su questo filamento indesiderato produrrà una molecola di DNA a doppia elica: in questa un filamento avrà nella sua estremità 5’ il secondo primer e nell’ estremità 3’ la sequenza complementare al primo primer f) Il filamento così generato rappresenta adesso uno stampo perfetto per i successivi cicli di amplificazione, e la concentrazione del DNA indesiderato aumenta proprio come quella della sequenza bersaglio g) Il frammento NON CORRETTO sintetizzato nei primi cicli della PCR può essere amplificato in modo efficiente nei cicli successivi d e f g E così via

     ~ PROGETTAZIONE dei PRIMERS Caratteristiche di un buon primer: Una sequenza di 16 bp sarà statisticamente presente solo una volta ogni 416 bp (~ 4 miliardi di basi) corrispondenti circa alla grandezza del genoma umano. Lunghezza: 16 bp o più   La Tm dipende dalla lunghezza e dalla sequenza del primers Tm = 4(G+C)+2(A+T)°C ~ 2-5°C al di sotto della più bassa Tm dei due primers usati T annealing  Tm primer 1 Tm primer 2 ~  Se la Ta dei due primers è molto diversa si possono verificare amplificazioni asimmetriche o a singolo filamento. Assenza di sequenze ripetute invertite che possano far ripiegare il primers su se stesso o di sequenze complementari fra i primers che causano l’amplificazione di dimeri dei primers 

STRATEGIE PER AUMENTARE LA SPECIFICITA’

TOUCHDOWN PCR Den. 30 sec 94°C Ann. 30 sec Tm(+5°C) -1°C/ciclo All. 1 min/Kb 72°C 10 cicli Ann. 30 sec Tm(-5°C) 20 Den. iniziale 3-5 min 94°C 1 ciclo  All. finale 7 min 72°C Manteni-mento 4°C Den. 30 sec 94°C Ann. 30 sec Tm(-5°C) All. 1 min/Kb 72°C 30 PCR CLASSICA TOUCHDOWN PCR in questa tecnica la temperatura di annealing viene progressivamente abbassata, cosicchè’ i primi annealing dei primer avvengano solo con sequenze perfettamente complementari. In una fase successiva l'abbassamento di temperatura TOUCHDOWN PCR in questa tecnica la temperatura di annealing viene progressivamente abbassata, cosicchè’ i primi annealing dei primer avvengano solo con sequenze perfettamente complementari.

HOT START NESTED PRIMER PCR La PCR “hot start” previene la formazione di questi prodotti non specifici in quanto l’enzima viene aggiunto dopo lo step di denaturazione iniziale. Durante l’allestimento della reazione di PCR o durante il riscaldamento iniziale del campione si possono verificare situazioni di appaiamento non specifico fra primers e stampo. Fra 40 e 50°C la Taq polimerasi ha un’efficiente attività polimerasica e può estendere i primers non correttamente appaiati. Perché realizzare una PCR “hot start”? Procedura: L’amplificazione è realizzata con un set di primers  Il prodotto è riamplificato con un set di primers interni ai precedenti I prodotti non specifici amplificati nella Ia PCR non saranno amplificati nella IIa 5’ 3’ Ia PCR IIa PCR pr. nested

TOUCHDOWN PCR in questa tecnica la temperatura di annealing viene progressivamente abbassata, cosicchè’ i primi annealing dei primer avvengano solo con sequenze perfettamente complementari. HOT START prevede il completamento della mistura di reazione con l'aggiunta della DNA-polimerasi solo quando questa ha raggiunto la temperatura di denaturazione, Si evita in questo modo che i primer possano legarsi aspecificamente a bassa temperatura NESTED PCR Consiste in una seconda PCR condotta sui prodotti di una prima PCR usando primer complementari a regioni della stesso segmento di DNA ma più interne rispetto alle regioni di annealing della prima coppia di primer. E’ altamente improbabile che tale coppia di primer possa dare un prodotto di amplificazione se il primo era errato. La presenza di un prodotto di amplificazione dopo la seconda PCR dovrebbe essere segno di specificità della reazione.

 MUTAGENESI R ER OR PRONE PCR ~ PREMESSA: La frequenza di errore delle DNA polimerasi è ~ allo 0,001 ‰ (una base ogni 106 nucleotidi) grazie ad un’attività corretrice 3’ 5’ che rimuove i nucleotidi male incorporati. E’ possibile indurre l’aumento di errori nella PCR utilizzando: Taq polimerasi prive di attività correttrice Basse temperature di annealing che diminuiscono la fedeltà Ineguali concentrazioni dei dNTP Elevate concentrazioni di MgCl2 Alto numero di cicli (60-80) Amplificazioni successive del prodotto di PCR 

ER OR PRONE PCR  R Si applicano condizioni della reazione di amplificazione che sono deliberatamente a bassa fedelta’. Il gene risultante viene trascritto e viene esaminata la sua attivita’. Questa forma accelerata di ‘evoluzione molecolare’ si e’ rivelata molto proficua per la produzione di proteine ingegnerizzate di tipo nuovo