DIFFERENZIAZIONE MIOGENICA DI CELLULE SATELLITI ISOLATE DAL MUSCOLO SCHELETRICO UMANO: ANALISI IN VITRO DEI RECETTORI ORMONALI Cecilia Romagnoli, Roberto Zonefrati, Carmelo Mavilia, Alessandra Aldinucci, Gianna Galli, Marco Innocenti, Annalisa Tanini, Laura Masi, Luisella Cianferotti, Maria Luisa Brandi Dott.ssa Cecilia Romagnoli, PhD Dipartimento di Chirurgia e Medicina Traslazionale Università degli Studi di Firenze Congresso OrtoMed, 17 Dicembre 2016, Firenze

MUSCOLO SCHELETRICO Tessuto più abbondante del corpo umano, rappresenta circa il 40% del peso totale di un adulto Tessuto dotato di straordinaria capacità di adattamento ai cambiamenti fisiologici, quali crescita, esercizio fisico, danno tissutale Funzione strutturale e meccanica (postura, respirazione, locomozione)

CELLULE SATELLITI Piccola popolazione di cellule staminali muscolari mononucleate (2-10% dei mionuclei totali nell’adulto sano), identificate nel 1961 da A. Mauro “Satellite cell of skeletal muscle fibers”, J Biophys Biochem Cytol Cellula Satellite Miofibra Mionucleo Lamina Basale

MIOGENESI Il processo di rigenerazione muscolare è controllato dai FATTORI MIOGENICI REGOLATORI, Myf-5, MyoD-1, MRF-4 e Myogenin, principali geni responsabili del commissionamento delle Cellule Satelliti Myf-5 MyoD-1 PAX-7 MRF-4 Myogenin

MUSCOLO SCHELETRICO = ORGANO SECRETORE Effettore importante nel mantenimento del sistema endocrino-metabolico MUSCLECRINOLOGY Branca dell'endocrinologia che si propone di studiare il muscolo scheletrico dal punto di vista della produzione di ormoni/citochine (MIOCHINE) ma anche in quanto organo bersaglio di vari ormoni.  Pederson B.K. Muscle as a Secretory Organ. Compr Physiol. 2013;3(3):1337-62.

OBIETTIVO DELLO STUDIO Isolare le Cellule Satelliti dal Muscolo Scheletrico Umano al fine di sviluppare un MODELLO in vitro utile per gli studi di differenziazione miogenica e per l’analisi di specifici recettori ormonali nello screening di nuove molecole terapeutiche da impiegare nel trattamento delle malattie muscolari ed endocrino-metaboliche Autorizzazione alla conduzione dello studio da parte del Comitato Etico Locale di AOU Careggi (RIF. n°14.017)

derivata dal muscolo scheletrico umano ALLESTIMENTO DI COLTURE PRIMARIE DERIVATE DA MUSCOLO SCHELETRICO UMANO (SKMCs) Osservazione in microscopia a contrasto di fase di una linea rappresentativa derivata dal muscolo scheletrico umano 10X -Frammentazione, -Digestione enzimatica con 3mg/ml collagenasi I a 37°C -Disgregazione meccanica -Pre-plating di 2 h

CARATTERIZZAZIONE DELLE SKMCs

DIFFERENZIAZIONE MIOGENICA * ** MyoD-1 MRF-4 * ** Myogenin Desmin Dopo una settimana nel terreno di induzione: le frecce indicano le cellule multi-nucleate allungate, riconducibili a miotubi. L’analisi quantitativa dell’espressione genica di MyoD-1, MRF-4, Myogenin e Desmin, ottenuta mediante RealTime q-PCR (normalizzazione con RPS18), evidenzia l’effettivo commissionamento dei mioblasti a differenziare in miotubi ed a maturare in miofibre. *p<0.005, **p<0.001

MYOSIN HEAVY CHAIN (MHC) Proteina essenziale per la contrazione del muscolo scheletrico e, pertanto, di primaria importanza insieme all’actina per il movimento muscolare 20X * 40X L’analisi quantitativa dell’espressione genica di MHC, indica l’avvenuta miogenesi e l’effettiva maturazione in miofibre. *p<0.005. La produzione di MHC è stata confermata anche dall’analisi in Immunofluorescenza della proteina. Sulla destra, immagini rappresentative, acquisite in LSCM ad ingrandimenti 20X e 40X, della produzione di MHC colorata in verde (Alexa Fluor 635), nuclei controcolorati in rosso con bromuro di etidio. Cecilia Romagnoli_Denothe_15 Novembre 2016

ANALISI DEI RECETTORI ORMONALI ** ° * ° L’analisi Real-Time q-PCR dei recettori ormonali (VDR, GCR, TRα, TRβ) ha evidenziato un incremento di espressione genica durante il differenziamento miogenico, suggerendo il coinvolgimento di tali recettori nella miogenesi **p<0.001; *p<0.005; °p<0.05

CONCLUSIONI Le Cellule Satelliti rappresentano un buon modello per lo studio in vitro dei meccanismi di differenziazione miogenica I recettori ormonali analizzati potranno essere utilizzati come potenziali target molecolari per aumentare la rigenerazione e la capacità endocrina del muscolo scheletrico

RINGRAZIAMENTI Lo studio è finanziato da: MIUR - Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca PRIN 2012: Endocrinologia del muscolo: caratterizzazione del muscolo scheletrico come organo bersaglio ed effettore nel sistema endocrino-metabolico - progetto MUSKENDO-

DIFFERENZIAZIONE MIOGENICA DI CELLULE SATELLITI ISOLATE DAL MUSCOLO SCHELETRICO UMANO: ANALISI IN VITRO DEI RECETTORI ORMONALI Cecilia Romagnoli, Roberto Zonefrati, Carmelo Mavilia, Alessandra Aldinucci, Gianna Galli, Marco Innocenti, Annalisa Tanini, Laura Masi, Luisella Cianferotti e Maria Luisa Brandi Dott.ssa Cecilia Romagnoli, PhD Dipartimento di Chirurgia e Medicina Traslazionale Università degli Studi di Firenze Congresso OrtoMed, 17 Dicembre 2016, Firenze