Valutazione dell’espressione di un gene: Real-Time PCR o PCR Quantitativa Valutazione dell’espressione di un gene: 1) Retrotrascrizione dell’RNA totale in cDNA Amplificazione gene specifica del cDNA con Real-Time PCR 3) Valutazione del prodotto PCR ottenuto durante la fase esponenziale per rilevamento della fluorescenza emessa Log [DNA] N° cicli Esponenziale Lineare Plateau Prodotto variabile

Real-Time PCR o PCR Quantitativa Rilevamento della fluorescenza associata all’amplificazione con computer; Misurazione in tempo reale del prodotto di PCR ottenuto durante la fase esponenziale, quando l’efficienza è infuenzata minimamente dalle variabili di reazione; Il prodotto di PCR incrementa esponenzialmente con il numero di cicli (n) e dipende dal numero di copie di stampo di partenza (T): P = (2)n T Incremento di fluorescenza

Real-Time PCR o PCR Quantitativa La fluorescenza si genera durante la PCR mediante l’impiego: coloranti intercalanti ( es. SYBR green), che si legano in maniera aspecifica a tutto il DNA sonde ad ibridazione, specifiche per il frammento di interesse, marcate con molecole fluorescenti Quantificazione assoluta: i campioni sono quantificati in modo assoluto, occorre una curva standard di riferimento Quantificazione relativa: Confronto dei CT dei diversi campioni. Il valore così ottenuto permette di determinare la concentrazione relativa del target di partenza La fluorescenza si genera durante la PCR per effetto di diverse possibili reazioni chimiche Le chimiche principali sono basate sia sul legame di coloranti fluorescenti che si intercalano nella doppia elica di DNA, come il SYBR Green, sia sull'ibridazione di sonde specifiche.

Real-Time PCR o PCR Quantitativa Linea soglia scelta dall’operatore In maniera da intersecare le curve di tutti i campioni nella fase esponenziale E’ il ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnale di fluorescenza del campione è maggiore rispetto a quello della Threshold CT = cycle Threshold

Real-Time PCR o PCR Quantitativa Cicli di amplificazione Fluorescenza Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il cui CT (=Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla quantità di campione iniziale P = (2)n T

Plot di amplificazione Numero di cicli CT Il valore così ottenuto viene normalizzato rispetto a quello di un gene espresso costitutivamente (-actina, GAPDH, HPRT, etc)

Saggio TaqMan con RealTime per genotipizzazione di SNP Saggio TaqMan: 2 primers, 2 sonde marcate con VIC e FAM per gli alleli (+quencer). La sonda si ibrida alla sequenza dell’amplicone. Se perfettamente appaiata e intatta non emette fluorescenza perché trasmette energia al quencer (es: TAMRA). La Taq pol avanza con polimerizzazione ma anche con e degrada la sonda perfettamente ibridata e separando il fluoroforo dal quencer. Rilevamento della fluorescenza specifica dell’allele

Perfect match: degradazione della sonda, rilascio del colorante fluorescente senza più quencer Mismatch della sonda: assenza di fluorescenza

Il software normalizza la fluorescenza del colorante reporter con la fluorescenza di un colorante di riferimento passivo (ROX) che sta in ciascun pozzetto