TECNICHE DI ANALISI MOLECOLARE A. Pomante, M.C. Magli, L. Gianaroli S.I.S.Me.R. Reproductive Medicine Unit, Bologna, Italy

TEST GENETICI PREIMPIANTO SCREENING DELLE ANEUPLOIDIE DIAGNOSI DI PATOLOGIE MONOGENICHE ANALISI DI RIARRANGIAMENTI STRUTTURALI PGT-SR PGT-A PGT-M

TECNICHE DI ANALISI MOLECOLARE TIMELINE 1990 1993 1997 2002 2010 2012 2014 2015 La PCR viene utilizzata per diagnosi di una patologia recessiva legata al cromosoma X (A. Handyside) Prima applicazione clinica della tecnica FISH (L. Gianaroli) Introduzione del Karyomapping (A. Hanyside) La PCR quantitativa viene proposta come metodo alternative per lo screening delle aneuploidie (N. Treff) Quantificazione DNA mitocondriale (E. Fragouli, A. Diez-Juan) Gli SNP array vengono utilizzati per lo screening delle aneuploidie (N. Treff) Validazione del Sistema NGS (F. Fiorentino) Prima applicazione della FISH per lo screening delle aneuploidie (S. Munnè) La tecnica array-CGH viene validata per lo screening delle aneuploidie (D. Wells)

Fluorescence in situ hybridization FISH BIOPSIA SEGNALE FLUORESCENTE FISSAZIONE DELLA CELLULA SU VETRINO E PERMEABILIZZAZIONE IBRIDAZIONE CON SONDE SPECIFICHE PER DETERMINATE REGIONI CROMOSOMICHE VALUTAZIONE DEL NUMERO DEI CROMOSOMI

CELLULE DEL TROFECTODERMA MILIONI DI COPIE DEL DNA DI PARTENZA AMPLIFICAZIONE DEL DNA GLOBULI POLARI BLASTOMERI CELLULE DEL TROFECTODERMA ~ 7pg AMPLIFICAZIONE 1-20 ng MILIONI DI COPIE DEL DNA DI PARTENZA La lunghezza dei prodotti di amplificazione e la resa variano in base al metodo di amplificazione utilizzato

Array-CGH DNA amplificato DNA di riferimento Marcatura con fluorocromi Quantità del DNA in analisi < del DNA di riferimento: LOSS Quantità del DNA in analisi > del DNA di riferimento: GAIN Stessa quantità del DNA in analisi e del DNA di riferimento: NESSUNA ALTERAZIONE

Ogni regione viene sequenziata diverse volte Next Generation Sequencing (NGS) DNA amplificato I frammenti vengono allineati da un software con la sequenza di un DNA di riferimento Ogni regione viene sequenziata diverse volte Il DNA viene frammentato TGCATGCTTAGTGC TGCATGCTTAGTGC ACCTGATGCTAGCTA TGGCAACTCGATTAA TGCATGCTTAGTGC ACCTGATGCTAGCTAGCTTGGCAACTTGATTAACAGTGCATGCTTAGTGC L’analisi di un software permette di discriminare la presenza di monosomie o trisomie a carico di un intero cromosoma o di una regione specifica

Ogni regione viene sequenziata diverse volte Next Generation Sequencing (NGS) DNA amplificato I frammenti vengono allineati da un software con la sequenza di un DNA di riferimento Ogni regione viene sequenziata diverse volte Il DNA viene frammentato ACCTGATGCTAGCTA TGGCAACTCGATTAA TGCATGCTTAGTGC ACCTGATGCTAGCTAGCTTGGCAACTTGATTAACAGTGCATGCTTAGTGC Il software identifica le differenze tra il DNA in analisi e la sequenza di riferimento

Next Generation Sequencing (NGS) BARCODING Ad ogni frammento del DNA in analisi viene aggiunta una sequenza, che avrà la funzione di un “codice a barre”, che distinguerà le sequenze appartenenti ad un dato genoma dalle altre. In questo modo, aggiungendo “ codici a barre” differenti a genomi diversi, è possibile l’analisi simultanea di più campioni Riduzione dei costi.

array-CGH NGS SCREENING CROMOSOMICO ANALISI DI ANOMALIE SEGMENTALI Tutti i cromosomi sono analizzati simultaneamente ANALISI DI ANOMALIE SEGMENTALI Possono essere rilevate solo le anomalie che generano sbilanciamenti cromosomici MOSAICISMO Può essere rilevato se la percentuale di cellule aneuploidi è elevata E’ possible rilevare e quantificare il mosaicismo TRASFERIMENTO DEGLI EMBRIONI Risultati disponibili in 24 ore- è possibile fare transfer in ciclo fresco Necessario accumulare diversi embrioni per l’analisi- crioconservazione COSTI STRUMENTAZIONE + +++ COSTO TEST I costi sono ridotti se si analizzano diversi campioni insieme ALTRI TEST DISPONIBILI ----- PGT-M e analisi DNA mitocondriale

NGS: DETECTION OF MOSAICISM Healthy Babies after Intrauterine Transfer of Mosaic Aneuploid Blastocysts. Greco E, Minasi MG, Fiorentino F. Il trasferimento di un embrione mosaico può esitare nella nascita di un bambino sano La rilevazione e la quantificazione del mosaicismo è uno strumento utile nella scelta degli embrioni da trasferire N Engl J Med 2015

LINEE GUIDA PER IL TRASFERIMENTO DI EMBRIONI MOSAICO EMBRIONI CON MOSAICISMO EUPLOIDE/MONOSOMIA EMBRIONI CON MOSAICISMO EUPLOIDE/TRISOMIA PER CROMOSOMI 1,3,4,5,6,8,9,10,11,12,17,19,20,22,X,Y EMBRIONI MOSAICO PER TRISOMIA CROMOSOMI 14, 15 (associati a Disomia Uniparentale) EMBRIONI MOSAICO PER TRISOMIA CROMOSOMI 2,7,16 (associati a ritardo sviluppo embrionale e fetale) EMBRIONI MOSAICO PER TRISOMIA CROMOSOMI 13,18,21 (possono esitare in una gravidanza a termine)

TECNICHE DI ANALISI MOLECOLARE PGT-M

ASSENZA DELLA MUTAZIONE PCR MUTAZIONE I metodi basati sulla PCR prevedono l’amplificazione della regione cromosomica contenente la mutazione ALLELE SANO AMPLIFICAZIONE ASSENZA DELLA MUTAZIONE

PRESENZA DELLA MUTAZIONE PCR MUTAZIONE I metodi basati sulla PCR prevedono l’amplificazione della regione cromosomica contenente la mutazione ALLELE MUTATO AMPLIFICAZIONE PRESENZA DELLA MUTAZIONE

ASSENZA DELLA MUTAZIONE FALLIMENTO AMPLIFICAZIONE PCR MUTAZIONE I metodi basati sulla PCR prevedono l’amplificazione della regione cromosomica contenente la mutazione ALLELE MUTATO AMPLIFICAZIONE ASSENZA DELLA MUTAZIONE FALLIMENTO AMPLIFICAZIONE

MULTIPLEX-PCR MUTAZIONE MARKERS INFORMATIVI PCR MULTIPLEX AMPLIFICAZIONE SIMULTANEA DI UNO O PIU’ MARKER ASSOCIATI ALLA MUTAZIONE MARKERS NON INFORMATIVI SET UP PRECLINICO PER INDIVIDUARE I MARKERS INFORMATIVI (DNA dei familiari della coppia) TEST CASO-SPECIFICO

Portatore ricombinante KARYOMAPPING Permette di individuare l’origine (materna o paterna) di ogni cromosoma PADRE Portatore MADRE Portatore MUTAZIONE MUTAZIONE Portatore ricombinante Affetto Ricombinante Affetto Sano Portatore Portatore

PCR vs KARYOMAPPING PCR KARYOMAPPING SET UP PRECLINICO Nesessario. Richiede tempo per essere messo a punto Set up semplificato RICHIEDE DNA DI UN INDIVIDUO AFFETTO NO SI RISCHIO DI ADO ++ - ALTRI TEST PGT-SR

TECNICHE DI ANALISI MOLECOLARE ANALISI DEL DNA MITOCONDRIALE Il DNA nucleare non è l’unico materiale genetico presente nelle cellule: i mitocondri contengono diverse molecule di DNA Il DNA mitocondriale ha una forma circulare e codifica per 13 proteine, 22 tRNA e 2 rRNA La quantità di DNA mitocondriale è stata messa in relazione alla qualità embrionale

TECNICHE DI ANALISI MOLECOLARE Il DNA mitocondriale PCR NGS Quantificazione del DNA mitocondriale Valutazione del numero di copie in rapporto al DNA nucleare Fertil Steril 2015 2015 Fertil Steril 2017 DATI DISCORDANTI

TECNICHE DI ANALISI MOLECOLARE Il DNA mitocondriale SEQUENZIAMENTO (SANGER) Analisi della sequenza del DNA mitocondriale Correlazione aplotipi-stato cromosomico Studio della segregazione dei mitocondri durante l’oogenesi

TECNICHE DI ANALISI MOLECOLARE TAKE HOME MESSAGE TECNICHE DI ANALISI MOLECOLARE PGT-A PGT-SR PGT-M PCR FISH NGS Array-CGH Karyomapping Negli ultimi anni sono state sviluppate nuove metodiche con l’obiettivo di aumentare l’accuratezza della diagnosi e ridurne i costi. Le tecniche di analisi molecolare di nuova generazione consentono l’analisi simultanea dell’assetto cromosomico e delle patologie monogeniche, oltre ad offrire la possibilità di avere informazioni anche sul DNA mitocondriale.

TECNICHE DI ANALISI MOLECOLARE SESSIONE: PGD/PGA TECNICHE DI ANALISI MOLECOLARE A. Pomante, C. Magli, L. Gianaroli S.I.S.Me.R. Reproductive Medicine Unit, Bologna, Italy