Corso di Biologia Molecolare e Bioinformatica Biologia Molecolare: Prof. Valeria Poli, Prof. Ferdinando Di Cunto Bioinformatica: Prof. Paolo Provero Poli: Lunedi’ e Mercoledi’ dall’ 1-10 al 12-11 Di Cunto: Giovedi’ dal 2-10, anche i Lu e Mer dal 17/11) Provero: tutti i venerdi’ ESAME: prova scritta in tre parti, svolte contemporaneamente Poli: domande aperte, a spazio limitato ORALE facoltativo, discussione dello scritto e domande ulteriori Prof.ssa Valeria Poli MBC valeria.poli@unito.it

…from genomes to function BIOLOGIA MOLECOLARE …from genomes to function La Biologia Molecolare e’ lo studio della biochimica a livello molecolare. Si occupa principalmente della comprensione delle interazioni tra i vari sistemi di una cellula, incluse (ma non solo) le interazioni tra DNA, RNA e proteine a livello della loro biosintesi e della regolazione della loro funzione. La biologia molecolare si sovrappone parzialmente con la genetica, la biologia cellulare e la biochimica. William Astbury (cristallografo che pose le basi per la scoperta della struttura del DNA), descrive cosi’ la biologia molecolare: (Molecular Biology is) not so much a technique as an approach, an approach from the viewpoint of the so-called basic sciences with the leading idea of searching below the large-scale manifestations of classical biology for the corresponding molecular plan. It is concerned particularly with the forms of biological molecules and [...] is predominantly three-dimensional and structural—which does not mean, however, that it is merely a refinement of morphology. It must at the same time inquire into genesis and function.

1953: Molecular Biology was born

1953: James Watson e Francis Crick scoprono la struttura del DNA: nasce la biologia molecolare

Direttore del National Human Genome Tutte le malattie con l’eccezione, forse, dei traumi hanno una base genetica: il progetto genoma (1984-2004) Craig Venter Francis Collins Presidente e fondatore della Celera Genomics Direttore del National Human Genome Research Institute

La comprensione dei meccanismi molecolari che regolano le interazioni tra macromolecole e il loro significato biologico passa attraverso la caratterizzazione della loro struttura primaria (sequenza) e la capacita’ di manipolarle. La conoscenza della sequenza del DNA genomico, sia codificante che non, ci permette la caratterizzazione della struttura dei geni e della struttura primaria delle proteine o degli RNA da loro codificati, e i meccanismi che regolano la loro espressione

L’era post-genomica E’ sufficiente conoscere la sequenza del genoma? E’ sufficiente avere individuato i geni all’interno del genoma?

Biologia Molecolare e Scienza dell’Informazione FROM GENOMES TO FUNCTIONS: Biologia Molecolare e Scienza dell’Informazione ---ATGTTGAAGTTCAAGTATGGTGTGCGGAAC--- --MLKFKYGVRNPPEA--

Biologia Molecolare e Scienza dell’Informazione FROM GENOMES TO FUNCTIONS: Biologia Molecolare e Scienza dell’Informazione ~

Noi siamo i nostri geni? (il genoma)

oppure i nostri geni interagiscono con l’ambiente, e noi siamo il nostro trascrittoma (insieme dei geni trascritti)?

Noi siamo i nostri geni? (il genoma) geni espressi (il trascrittoma) il trascrittoma e l’ambiente -> il proteoma

Controllo trascrizionale Genoma Insieme delle informazioni genetiche che caratterizzano un organismo. Controllo trascrizionale Trascrittoma Insieme dei trascritti (codificanti e non) prodotti da una determinata popolazione cellulare. Per ogni tipo cellulare diverso sono espressi all’incirca 10000 geni diversi. Controllo post-trascrizionale Proteoma Insieme delle proteine prodotte da una determinata popolazione cellulare. 13

--MLKFKYGVRNPPEA-- FROM GENOMES TO FUNCTIONS: ---ATGTTGAAGTTCAAGTATGGTGTGCGGAAC--- THE MISSING LINK: HOW IS GENE TRANSCRIPTION REGULATED? Sequence is not enough! EPIGENETICS! --MLKFKYGVRNPPEA-- AND FURTHER: HOW IS GENE EXPRESSION REGULATED? POST-TRANSCRIPTIONAL CONTROL

IL CONTROLLO DELL’ESPRESSIONE GENICA IL CONTROLLO TRASCRIZIONALE IL CONTROLLO POST-TRASCRIZIONALE

PROGRAMMA Concetti e implicazioni del controllo dell’espressione genica 1. Il controllo trascrizionale Ripasso dei concetti di base della regolazione trascrizionale negli eucarioti La cromatina e il controllo dell’espressione genica negli eucarioti Gli attivatori e i repressori trascrizionali Coattivatori e corepressori trascrizionali Enhaneosoma e repressosoma Tecniche per l’analisi della regolazione trascrizionale Regolazione trascrizionale di programmi complessi: lo sviluppo della Drosophila e la regolazione circadiana. Genona e epigenoma: Le modificazioni epigenetiche: modificazioni covalenti degli istoni, il codice istonico Le modificazioni epigenetiche: la metilazione del DNA Coordinamento tra trascrizione, maturazione e trasporto dell’RNA 2. Il controllo post-trascrizionale Meccanismi che determinano la produzione di varianti alternative a partire dalle stesse unità trascrizionali Regolazione spaziale della traduzione L’interferenza dell’RNA e i microRNA: funzioni fisiologiche e patologiche

CONTROLLO TRASCRIZIONALE

Organismi unicellulari Duplicazione cellulare Risposta agli stimoli dell’ambiente esterno

Organismi pluricellulari Duplicazione cellulare Sviluppo e differenziamento di tipi cellulari specializzati Risposta agli stimoli dell’ambiente esterno (alle cellule!) Coordinamento tra le funzioni dei diversi tipi cellulari

Virus Duplicazione del proprio genoma sfruttando a proprio vantaggio i meccanismi molecolari delle cellule e degli organismi ospiti

Le cellule rispondono in modo complesso a stimoli complessi Unicellulari Pluricellulari Assenza di glucosio Presenza di lattosio Induzione dei geni responsabili dell’utilizzazione del lattosio

La maggior parte delle risposte cellulari richiede l’attivazione e/o la repressione coordinata di molti geni

In tutti gli organismi viventi le informazioni contenute nel genoma non si esprimono contemporaneamente, e sono finemente regolate. Geni ad espressione costitutiva (housekeeping) Geni ad espressione condizionale (inducibili, reprimibili) Geni specializzati (tessuto/funzione specifici, che a loro volta possono essere costitutivi o condizionali)

Differenziamento cellulare

La produzione di tipi cellulari specializzati in genere non dipende da riarrangiamenti del DNA

La maggior parte delle risposte/funzioni cellulari richiede l’attivazione e/o la repressione coordinata di molti geni il trascrittoma…!

Attivazione/inattivazione dell’espressione genica negli eucarioti: Decisioni cellulari durante lo sviluppo -> differenziamento (geni accesi/spenti) Regulazione del ciclo cellulare (attivazione e inattivazione ciclica) Attivazione cellulare -> in risposta a mediatori esterni quali fattori di crescita, ormoni etc. (reversibile, rapida)

Come funziona la trascrizione ?

RNA Polimerasi: il problema e’ la scelta del substrato

(i fattori di trascrizione) Il controllo della trascrizione è basato sul riconoscimento di corte sequenze di DNA da parte di diverse classi di proteine (i fattori di trascrizione)

Come funziona la trascrizione ? I promotori e le RNA polimerasi sono asimmetrici TTACGTAACGTCAGAACGTATAAACCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT AATGCATTGCAGTCTTGCATATTTGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 5’ 3’ Promotore

Come funziona la trascrizione ? I promotori e le RNA polimerasi sono asimmetrici TTACGTAACGTCAGAACGTATAAACCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT AATGCATTGCAGTCTTGCATATTTGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 5’ 3’ Promotore

Come funziona la trascrizione ? I promotori e le RNA polimerasi sono asimmetrici mRNA 3’ 5’ TTACGTAACGTCAGAACGTATAAACCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT AATGCATTGCAGTCTTGCATATTTGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 5’ 3’ CCGGAACGUAGGG Promotore

Cosa succede se inverto il promotore ? 5’ 3’ TTACGTAACGTCAGAACGTTTATACCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT AATGCATTGCAGTCTTGCAAATATGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’

Cosa succede se inverto il promotore ? 5’ 3’ TTACGTAACGTCAGAACGTTTATACCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT AATGCATTGCAGTCTTGCAAATATGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’

Cosa succede se inverto il promotore ? 5’ 3’ TTACGTAACGTCAGAACGTTTATACCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT AATGCATTGCAGTCTTGCAAATATGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’ AGUCUUGC 3’ 5’ mRNA

Strategie di controllo dell’espressione genica nei batteri Genoma estremamente compatto L’ RNA polimerasi-oloenzima puo’ riconoscere il promotore in assenza di altre proteine Organizzazione dei geni in operoni Regioni di controllo molto piccole (in genere <200 bp)

Inizio trascrizionale nei procarioti

Strategie di controllo: affinità del fattore Sigma per i promotori SIGMA FACTOR PROMOTERS RECOGNIZED σ70 most genes σ32 genes induced by heat shock σ28 genes for stationary phase and stress response genes involved in motility and chemotaxis σ54 genes for nitrogen metabolism

Controllo addizionale mediante proteine capaci di legare il DNA

Controllo negativo: l’operon del triptofano Promotore forte: operatore sempre attivo a meno che non venga spento da un repressore che lo lega

Controllo negativo: l’operon del triptofano repressore inattivo repressore attivo

Integrazione di due informazioni: l’operon del lattosio Promotore piu’ debole: per essere trascritto richiede il legame di un attivatore. L’interazione tra repressore (che lega l’operatore) e attivatore rende il controllo piu’ stringente e più flessibile

Geni del triptofano: promotore forte (operatore e repressore) Lac operon: promotore piu’ debole (operatore e repressore + attivatore)

Controllo trascrizionale mediante azioni a distanza (Lac repressor)

Controllo trascrizionale mediante azioni a distanza

Il controllo della espressione genica negli eucarioti è molto più sofisticato che nei procarioti Compartimentalizzazione di trascrizione e traduzione Genomi poco compatti, con grande quantità di DNA non codificante Sequenze geniche suddivise in esoni ed introni Regioni di controllo dei geni molto grandi (anche > 50000 bp) e distanti RNA polimerasi incapaci di iniziare la trascrizione senza altri fattori RNA messaggeri codificanti per singole proteine, no operoni

La regolazione dell’espressione genica avviene a numerosi livelli: 9.2

Diversamente dai procarioti, la trascrizione dei geni eucarioti e’ controllata da numerosi elementi GTF + PolII=macchinario trascrizionale basale Perche’? LA CROMATINA

I nucleosomi sono costituiti da DNA avvolto attorno a un ottamero costituito da 2 copie degli istoni H2A, H2B, H3 e H4

Il DNA eucariotico è organizzato sotto forma di cromatina

Il nucleosoma

Acetilazione degli istoni Gli istoni nel nucleosoma contengono code aminoterminali flessibili che sporgono dalla loro porzione globulare, ricche in lisine (aa con carica positiva) in virtu’ della carica positiva, le lisine interagiscono con i gruppi fosfato del DNA -> COMPATTAMENTO le lisine possono essere reversibilmente acetilate e deacetilate da enzimi specifici (HAT, HDAC) l’acetilazione neutralizza la carica positiva eliminando l’interazione con il DNA e rendendo meno facile la compattazione dei nucleosomi.

Oltre alla generica attività inibitoria della trascrizione, i nucleosomi possono esercitare attività inibitorie specifiche della trascrizione a seconda del posizionamento: - se posizionati sull’inizio di trascrizione - se posizionati in modo da impedire il legame di un attivatore trascrizionale

Il posizionamento dei nucleosomi sul DNA non e’ casuale alcune sequenze regolatorie (es enhancer del gene per l’IFNbeta) sono in grado di posizionare il nucleosoma in modo specifico Le regole però non sono state ancora del tutto comprese!

cis and trans factors affecting nucleosome positioning in S. cerevisiae The most important cis factor affecting local nucleosome positioning is the AT content of the local DNA. Poly(dA:dT) tracts act as antinucleosomal “barriers”. These barriers do not form a nucleosome, but highly positioned nucleosomes are often formed immediately adjacent to the barrier element. Second, the formation of nucleosomes is further enhanced by DNA sequences containing regularly spaced A/T dinucleotides (approximately one dinucleotide every 10 bp) and G/C dinucleotides (in between the A/T dinucleotides). Third, nucleosomes are also positioned by the steric hindrance of neighboring nucleosomes, much like beads on a string. This positioning signal is not perfect and deteriorates with increasing distance from strongly positioned nucleosomes, explaining why nucleosome positioning becomes increasingly “fuzzy” with increasing distance to positioning signals cis and trans factors affecting nucleosome positioning in S. cerevisiae. (A) The most important cis factor affecting local nucleosome positioning is the AT content of the local DNA. Poly(dA:dT) tracts act as antinucleosomal “barriers.” These barriers do not form a nucleosome, but highly positioned nucleosomes are often formed immediately adjacent to the barrier element. Second, the formation of nucleosomes is further enhanced by DNA sequences containing regularly spaced A/T dinucleotides (approximately one dinucleotide every 10 bp) and G/C dinucleotides (in between the A/T dinucleotides). Third, nucleosomes are also positioned by the steric hindrance of neighboring nucleosomes, much like beads on a string. This positioning signal is not perfect and deteriorates with increasing distance from strongly positioned nucleosomes, explaining why nucleosome positioning becomes increasingly “fuzzy” with increasing distance to positioning signals. (B) trans factors like ATP-consuming chromatin remodeling factors can remove (left) or slide (middle) nucleosomes. In addition, histone-modifying enzymes can add or remove covalent modifications to certain histone residues. For example, histone acetyltransferases (HATs) can add an acetyl residue, which can be removed by histone deacetylases (HDACs). Acetyl groups add an electronegative charge to the histones, which repulses the negatively charged DNA polymer, resulting in a modified, “looser” DNA-histone interaction and an increased accessibility of the DNA. Jansen A , and Verstrepen K J Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2011;75:301-320

Il posizionamento dei nucleosomi sul DNA non e’ casuale

cis and trans factors affecting nucleosome positioning in S. cerevisiae Trans factors like ATP-consuming chromatin remodeling factors can remove (left) or slide (middle) nucleosomes. In addition, histone-modifying enzymes can add or remove covalent modifications to certain histone residues. For example, histone acetyltransferases (HATs) can add an acetyl residue, which can be removed by histone deacetylases (HDACs). Acetyl groups add an electronegative charge to the histones, which repulses the negatively charged DNA polymer, resulting in a modified, “looser” DNA-histone interaction and an increased accessibility of the DNA. cis and trans factors affecting nucleosome positioning in S. cerevisiae. (A) The most important cis factor affecting local nucleosome positioning is the AT content of the local DNA. Poly(dA:dT) tracts act as antinucleosomal “barriers.” These barriers do not form a nucleosome, but highly positioned nucleosomes are often formed immediately adjacent to the barrier element. Second, the formation of nucleosomes is further enhanced by DNA sequences containing regularly spaced A/T dinucleotides (approximately one dinucleotide every 10 bp) and G/C dinucleotides (in between the A/T dinucleotides). Third, nucleosomes are also positioned by the steric hindrance of neighboring nucleosomes, much like beads on a string. This positioning signal is not perfect and deteriorates with increasing distance from strongly positioned nucleosomes, explaining why nucleosome positioning becomes increasingly “fuzzy” with increasing distance to positioning signals. (B) trans factors like ATP-consuming chromatin remodeling factors can remove (left) or slide (middle) nucleosomes. In addition, histone-modifying enzymes can add or remove covalent modifications to certain histone residues. For example, histone acetyltransferases (HATs) can add an acetyl residue, which can be removed by histone deacetylases (HDACs). Acetyl groups add an electronegative charge to the histones, which repulses the negatively charged DNA polymer, resulting in a modified, “looser” DNA-histone interaction and an increased accessibility of the DNA. Jansen A , and Verstrepen K J Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2011;75:301-320

Il posizionamento dei nucleosomi sul DNA non e’ casuale e dipende: dalla sequenza da complessi proteici che rimodellano la cromatina da proteine (TFs) che legano il DNA e che possono influenzare il posizionamento Alcuni TF possono legare il DNA complessato nei nucleosomi, altri no e hanno quindi prima bisogno che i nucleosomi vengano riposizionati: rimodellamento

Spesso il rimodellamento riposiziona i nucleosomi in modo da permettere oppure impedire la trascrizione

in particolare - acetilasi degli istoni La complessita’ del macchinario trascrizionale di un gene eucariote e’ in buona parte correlato alla natura repressoria della cromatina. Tale repressione deve essere rilasciata prima che la trascrizione possa avvenire. Cio’ avviene ad opera dei numerosi attivatori e co-attivatori coinvolti in particolare - acetilasi degli istoni - proteine che rimodellano/riposizionano i nucleosomi GTF + PolII=macchinario trascrizionale basale

I fattori di trascrizione individuano le regioni da trascrivere TATA Basal tr. machinery TBP TFIIs Pol.II PROMOTORE PROSSIMALE CORE (ESSENZIALE) ~ -200 ~ -50 ENHANCER (~ 100 bp) I fattori di trascrizione individuano le regioni da trascrivere La loro funzione principale e’ di facilitare l’assemblaggio del macchinario basale di trascrizione sul promotore essenziale (core). Questo avviene - tramite reclutamento di altri TF e GTF - tramite reclutamento di co-attivatori: HAT oppure attivita’ che rimodellano la cromatina - tramite attivita’ acetilasiche intrinsiche

La regolazione dell’espressione genica avviene a numerosi livelli: 9.2

Il controllo della trascrizione avviene a numerosi livelli: Pre-attivazione (Induzione di uno stato trascrizionalmente competente) Inizio/re-inizio della trascrizione Elongazione del trascritto Maturazione del trascritto Terminazione del trascritto Fattori di trascrizione legati a specifici promotori/enhancers Co-attivatori (acetilasi degli istoni, attivita’ che rimodellano la cromatina) Fattori “generali” di trascrizione (GTFs) e RNA polimerasi

Gli eucarioti contengono 3 RNA polimerasi diverse

L’ RNA Polimerasi II Catalizza la trascrizione di tutti i geni codificanti proteine (mRNAs), piu’ 4 snRNAs che partecipano allo splicing E’ formata da 2 subunita’ grandi (Large) L (128-150 kDa) e L’ (160-220 kDa), e da 12-15 subunita’ piu’ piccole, alcune specifiche ed altre in comune con l’ RNA Pol I e/o III L’estremita’ carbossi-terminale della subunita’ piu’ grande, L’, contiene una sequenza di 7 aa (il dominio carbossi-terminale o CTD) che e’ ripetuto molte volte (26x in lievito, 52x in mammiferi) Il CTD (Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser) e’ essenziale per la vitalita’ di un’organismo, e viene fosforilato differenzialmente durante la trascrizione

L’inizio della trascrizione negli eucarioti richiede l’assemblaggio di un complesso multiproteico reso possibile dal looping del DNA

Il promotore essenziale (core promoter) Determina il sito di inizio della trascrizione e dirige il legame dell’ RNA Pol II Il promotore essenziale più frequente per l’RNA Pol II è la TATA box: la sua sequenza e’ altamente conservata (TATAAA); si trova prevalentemente in geni che vengono trascritti rapidamente, ed e’ localizzata ~25-30 bp a monte del sito di inizio della trascrizione. la TATA box dirige l’inizio della trascrizione a siti ben definiti Isole CpG: proprio di molti geni “house-keeping”. La trascrizione comincia a siti multipli disseminati in una regione di circa 20-200-bp.

L’inizio della trascrizione da parte dell’RNA Pol II richiede multipli fattori Fattori di trascrizione generali (GTF) insieme con l’RNA Pol II formano l’apparato trascrizionale basale TBP (che con i fattori associati a TBP (TAF) forma -> TFIID) TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH Fattori di trascrizione specifici, richiesti per la trascrizione in presenza di cromatina servono per reclutare e assemblare l’apparato trascrizionale Si legano a elementi di riconoscimento sulle regioni regolatorie Multipli fattori di trascrizione sono normalmente coinvolti nell’attivazione di un gene Co-attivatori, che sono richiesti per la trascrizione in presenza di cromatina TAFs Acetilasi di istoni (HATs) Proteine che rimodellano la cromatina (SWI/SNF)

Il promotore essenziale (core promoter) Determina il sito di inizio della trascrizione e dirige il legame dell’ RNA Pol II Il promotore essenziale più frequente per l’RNA Pol II è la TATA box: la sua sequenza e’ altamente conservata (TATAAA); si trova prevalentemente in geni che vengono trascritti rapidamente, ed e’ localizzata ~25-30 bp a monte del sito di inizio della trascrizione. la TATA box dirige l’inizio della trascrizione a siti ben definiti Isole CpG: proprio di molti geni “house-keeping”. La trascrizione comincia a siti multipli disseminati in una regione di circa 20-200-bp.

I GTF servono ad assemblare il complesso trascrizionale dell’RNA polimerasi II Inizio della trascrizione negli eucarioti: Modello sequenziale TBP + TAFs=TFIID Lodish

Inizio della trascrizione negli eucarioti: reclutamento dell’oloenzima TBP + TAFs=TFIID

Necessarie molte attività diverse TBP + TAFs=TFIID

COME AGISCONO GLI ATTIVATORI: Gli attivatori (fattori di trascrizione -TF- specifici), legandosi a monte del promotore essenziale o a livello dell’enhancer, possono agire facilitando il reclutamento di GTF grazie al ripiegamento (looping) del DNA

COME AGISCONO GLI ATTIVATORI: Gli attivatori (TF) possono anche agire reclutando co-attivatori al promotore: Co-attivatori: NON legano specificamente il DNA NON richiesti per la trascrizione basale (in assenza di cromatina) Necessari per la funzione dei fattori di trascrizione specifici in presenza di cromatina possono avere funzioni enzimatiche (acetilazione istoni, rimodellamento cromatina), oppure di adattatori molecolari, o rafforzare le interazioni dell’apparato trascrizionale con il promotore

COME AGISCONO GLI ATTIVATORI: OLOENZIMA RNA POLIMERASI II: la PolII si trova gia’ associata con TFIIF, altri GTF, e numerosi co-attivatori (che formano un complesso detto MEDIATORE - ~ 2 Mda) L’associazione con il Mediatore avviene tramite il CTD:

COME AGISCONO GLI ATTIVATORI: Gli attivatori possono anche agire reclutando l’oloenzima tramite interazioni con componenti del mediatore il mediatore agisce da co-attivatore TBP + TAFs=TFIID

Co-attivatori: TAF (TBP-associated factors) Un modello per le funzioni associate a TFIID Naar, 2001, Ann. Rev. Biochem. 70, 475

Modello di interazioni sinergistiche tra attivatori (TF) e componenti del complesso del Mediatore Malik and Roeder, 2000, TIBS 25, 277

Co-attivatori Adattatori molecolari come nel mediatore Complessi che contengono componenti capaci di acetilare la cromatina (HAT) (es. le proteine CBP/p300) Complessi che contengono attivita’ ATP-dipendenti capaci di rimodellare la cromatina riarrangiando i nucleosomi (es. complesso Swi/Snf nel lievito)

Meccanismi di attivazione: acetilazione degli istoni e rimodellamento locale della cromatina TBP + TAFs=TFIID