Vitamina C: funzioni metaboliche mantenimento metalli in forma ridotta cattura di specie reattive di ossigeno sintesi del collageno assimilato dall’uomo attraverso la dieta (no biosintesi) Vitamina C: usato come additivo alimentare farmaco sintesi prevalentemente chimica (Reichstein e/o sue varianti) sintesi in natura: animali e piante (figura) 1 2 3 4 5 6 7

Figura 34.3.1 - Biosintesi della vitamina C nelle piante (a destra) e negli animali (a sinistra). 9,J = esoso chinasi, 8 = fosfo glucomutasi, 7 = glucosio-1P uridil trasferasi, 6 = UDP glucosio deidrogenasi, 5 = glucuronato-1P uridil trasferasi, 4 = glucuronato chinasi, 3 = glucuronato reduttasi. 3a = uronolattonasi, 2 = aldonolattonasi, 2a = gulurono lattone reduttasi, 1 = gulono lattone ossidasi; I = glucosio-6P isomerasi, H = mannosio-6P isomerasi, G = fosfo mannomutasi, F = mannosio-1P guanilil trasferasi, E = GDP mannosio epimerasi, D = idrolasi, C = fosfatasi, B = galattosio deidrogenasi, A = galattono lattone deidrogenasi.

USO del LIEVITO per la PRODUZIONE Organismo GRAS (S. cerevisiae) Produce acido eritro ascorbico da arabinosio: Arabinosio  arabinono lattone  eritro-ascorbato (C5) Sintesi simile a quella delle piante: Galattosio  galattono lattone  ascorbato (C6) 4. Eritro-ascorbato: proprietà chimiche simili all’ascorbato ARA ALO

BASSA SPECIFICITA’ DI SUBSTRATO ARA, ALO PROPRIETA’ DEGLI ENZIMI DI LIEVITO ALO e ARA arabinosio galattosio ARA (in vitro) arabino lattoni galattono lattoni 1,4 lattoni gulono lattoni galattono lattoni arabino lattoni ALO (in vivo, in vitro, ricombinanti in E. coli) ascorbato eritroascorbato BASSA SPECIFICITA’ DI SUBSTRATO ARA, ALO endogene Lievito + galattosio Ascorbato intracellulare

SCOPO DEL LAVORO: Sovraespressione dei geni biosintetici (ALO e ARA) e attività su C6 Rilascio ascorbato nel terreno di coltura Uso di lieviti alternativi (Z. bailii)

Attività ALO - Produzione di acido ascorbico intracellulare in presenza di: GALATTONO LATTONE (Gal) GULONO LATTONE (Gul) ALO mantiene una bassa specificità di substrato (Gal e Gul) in vivo ALO presente anche in Z. bailii

Attività ARA - Produzione di acido ascorbico intracellulare in presenza di: GALATTOSIO Bassa specificità di substrato in vivo di ARA ARA presente anche in Z. bailii

MAPPA METABOLICA Arabinosio Arabino lattone Eritro ascorbato ARA ALO (lievito) Galattosio Galattono lattone Ascorbato ALO/AGD ARA/LGDH (lievito/A. thaliana) (galattosio deidrogenasi) (galattono lattone deidrogenasi) Gulono lattone Ascorbato GulO (R. norvegicus) (gulono lattone ossidasi)

SECREZIONE ASCORBATO DA LIEVITI RICOMBINANTI Galattosio Galattosio Galattono lattone Ascorbato TpiALO1 TpiAGD ARA Galattono lattone Ascorbato secreto GENI SOVRAESPRESSI Funziona!

Secrezione di ascorbato in seguito a somministrazione di galattono-lattone a lieviti sovra-esprimenti ALO1 o AGD

Secrezione di ascorbato in seguito a somministrazione di galattosio a lieviti sovra-esprimenti ALO1 o AGD

SECREZIONE ASCORBATO DA LIEVITI RICOMBINANTI Galattosio Galattono lattone Ascorbato TpiARA1 TpiLGDH ALO Ascorbato secreto GENI SOVRAESPRESSI Non funziona!

Sovra-espressione simultanea Secrezione di ascorbato in seguito a somministrazione di galattosio a lieviti sovra-esprimenti ARA1 o LGDH Sovra-espressione simultanea Aumentata Secrezione

Uso di Zygosaccharomyces bailii ricombinante per la produzione di ascorbato Caratteristiche di Z. bailii: osmofilo acidofilo termotollerante resistente a sostanze chimiche Vantaggi di processo Secrezione di ascorbato

BIOCONVERSIONE di galattosio da lievito ricombinante sovraesprimente ALO1 o ALO1 + LGDH

Prospettive: Uso di altre vie metaboliche. Esempio gulono lattone ossidasi (GulO) di topo  per ora solo ascorbato intracellulare Riempimento del buco metabolico tra glucosio (substrato a basso costo) e galattosio (substrato ad alto costo) Sauer M et al. Production of L-ascorbic acid by metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae and Zygosaccharomyces bailii (2004) Appl. Environ. Microbiol. 70:6086-6091