Virus dell’epatite B (HBV, fam. Hepadnaviridae): diffusione mondiale, prevalentemente asintomatico, letalità 1% cronicizzazione  5-10% casi  cirrosi epatica e/o epato-carcinoma epidemiologia: ½ della popolazione mondiale ha contratto HBV 350 milioni malati cronici 2% della popolazione in America-Europa, 10-25% in Asia-Africa propagazione: sangue, liquidi biologici si replica solo nell’uomo e nello chimpanzee

STRUTTURA DELLA PARTICELLA VIRALE HBV Particella sferica (40-50 nm) proteica (particella Dane) contenente il genoma virale (DNA doppio filamento parziale, 3.2 kbp) DNA virale clonato e amplificato in E. coli Espressione dei geni virali in E. coli per la produzione di vaccini senza successo: prodotto proteico instabile e degradato prodotto proteico dannoso per l’ospite?

basso fosfato inorganico  induzione Scopo del lavoro: Espressione dei geni virali a partire dal promotore regolato della fosfatasi acida P-60 di lievito: basso fosfato inorganico  induzione alto fosfato inorganico  repressione fusione ‘pulita’ promotore-gene Miyanohara A et al. Expression of hepatitis B surface antigen gene in yeast (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1-5

COSTRUZIONE del VETTORE pAM82 Capping (RNA) ATG (protein) Hogness box (TATA box) Sal I digestione Sal I digestione Bal 31 inserzione polilinker Xho I ligazione Xho I

MAPPA DEI VETTORI DI ESPRESSIONE pAH203 e pAH301 Capping (RNA) Hogness box (TATA box) Xho I HBsAg HBcAg Bam HI Capping (RNA) Hogness box (TATA box) Xho I HBsAg Xho I (Bam HI) Trasformazione AH22 (selvatico, regolato ) e AH22 pho80 (mutante costitutivo)  selezione leu+

Saggio di reattività immunologica Crescita dei trasformanti Sospensione delle cellule in basso fosfato (induzione) a 1.5x107 cell/ml Lisi parete cellulare (zymoliase) Lisi sferoplasti (triton X-100) Estrazione e purificazione proteine solubili (centrifugazione) Analisi estratti (50 g proteina) con test immuno-radiochimici (anticorpi marcati) Curva standard con HBsAg da siero umano (ipotesi che i due antigeni – umano e da lievito – reagiscano similmente) Solo i trasformanti producono attività antigenica La produzione è sotto il controllo trascrizionale del fosfato L’ assenza di HBcAg non altera la produzione

Caratteristiche di produzione: I trasformanti sono stabili (test su 6 generazioni) La produzione è di 5x105 molecole di HBsAg per cellula Le molecole si assemblano in particelle sferiche da 20-22 nm Le particelle NON CONTENGONO DNA VIRALE

Attività immunogenica delle particelle di lievito: Preparazione degli estratti da lievito Iniezione sottocutanea in cavie Misura dell’attività anticorpale anti HBsAg nel siero delle cavie: positivo, le particelle sono IMMUNOGENICHE Controllo con particelle virali da siero umano Misura dell’attività anticorpale anti HBcAg, HBeAg: negativo