Le PROTEINE sono i biopolimeri maggiormente presenti all’interno delle cellule, dal momento che costituiscono dal 40 al 70% del peso a secco. Svolgono funzioni biologiche di fondamentale importanza e possono essere divise in 7 gruppi principali: proteine strutturali (collagene, cheratine); proteine catalitiche (enzimi); • proteine di trasporto (emoglobina, mioglobina, albumina); • proteine regolatorie (ormoni); • proteine di protezione (anticorpi, trombina); proteine contrattili (actina, miosina, troponina, tropomiosina) proteine di riserva (ovoalbumina, caseina)

La cinetica enzimatica Può fornire informazioni sul meccanismo di azione di un enzima Fornisce informazioni sul ruolo di un enzima in condiz. cellulari e sulle risposte a variazioni di concentrazioni di metaboliti Fornisce informazioni su come un enzima è regolato Consente di caratterizzare inibitori (ad es., di interesse farmacologico) E’ utile nel dosaggio di attività enzimatiche quali indici diagnostici E’ utile nel discriminare diverse forme enzimatiche sia fisiologiche (isoenzimi) sia anomale È utile nella messa a punto di dosaggi enzimatici di substrati

Velocità di reazione ed attività enzimatica Velocità di reazione: quantità di substrato trasformato nel tempo v = d [S] / dT = d [P] / dT

Inibizione enzimatica Reversibile – Competitiva – Non competitiva – Acompetitiva Irreversibile – Si legano all’enzima con legami stabili (covalenti) – Non possono essere rimossi con mezzi semplici – Cinetica analoga all’inibizione non competitiva – Sono utilizzati: nello studio dei siti catalitici come farmaci (anti-metaboliti) come anti-parassitari

Parametri cinetici Km kcat Numero di turn-over: Massimo numero di molecole di substrato convertite nella unità di tempo da una molecola (sito) di enzima Vmax kcat/Km (costante efficienza o di specificità) Dà una idea della efficienza relativa con cui vengono trasformati substrati diversi (specificità) Dà una idea della efficienza catalitica dell’enzima (enzimi “perfettamente” evoluti hanno costanti che si approssimano alla diffusione) Inibizione (Ki)

Dosaggi enzimatici in Biochimica Clinica Enzimi plasmatici a scopo diagnostico carenze/difetti enzimatici responsabili di alterazioni metaboliche e patologie correlate Dosaggi enzimatici Valutazioni cinetiche Valutazioni cliniche Dosaggio di metaboliti Valutazioni merceologiche (alimentari)

Localizzazione Enzimatica Gli enzimi si possono trovare: Liberi nelle cellule di diversi tessuti ed organi Confinati in particolari strutture all’interno delle cellule stesse In un determinato tessuto od organo specifico. Quando le strutture cellulari vengono danneggiate gli enzimi cellulari si liberano e si riversano nel circolo sanguigno. In questo modo, un aumento della loro concentrazione nel campione può rappresentare un indice abbastanza preciso di un danno cellulare.

Enzimi plasmatici da dosare: enzimi attivi nel plasma (fattori della coagulazione) enzimi attivi in fluidi extra-cellulari (ad esempio, enzimi digestivi) enzimi del metabolismo cellulare ubiquitari organo (tessuto)-specifici

Inibitori come farmaci: i sulfamidici

Inibitori come farmaci: inibitori delle HIV proteasi Il virus HIV utilizza aspartato proteasi per scindere poliproteine Le proteasi tagliano legami particolari (Phe-Pro; Tyr-Pro) occorrono inibitori ad alta specificità

Meccanismi responsabili di un aumento degli enzimi nel plasma 1)necrosi o danno cellulare indotto da fattori tossici o da ischemia, in cui gli enzimi normalmente contenuti nel citoplasma fuoriescono dalle cellule per citolisi 2)variazione della quantità di tessuto: aumentato turnover cellulare che si realizza normalmente durante l'accrescimento, la rigenerazione cellulare o anche in corso di neoplasie 3)alterata sintesi: induzione enzimatica in cui aumenta la sintesi proteica dell'enzima 4)ostruzione dei dotti escretori per cui enzimi normalmente presenti nelle secrezioni esocrine si riversano nel plasma 5)variazione nella permeabilità cellulare 6)alterazione nella velocità di inattivazione/ degradazione 7)altri fattori che influenzano l’attività (inibitori, carenza di cofattori...)

Inibitori enzimatici come agenti terapeutici Inibitore Enzima Applicazione AZT Trascrittasi inversa HIV Ritonavir, saquinavir Proteasi HIV Sulfonammidi Diidrofolato sintasi Infezioni batteriche Trimetoprim, methotrexate Diidrofolato reduttasi Allopurinolo Xantina ossidasi Gotta Statine HMG CoA reduttasi Sintesi colesterolo Aspirina Cicloossigenasi Sintesi prostaglandine