Perche' K. lactis? Produzione di -galattosidasi a livello industriale  sviluppo delle conoscenze su questo lievito Messi a punto sistemi di trasformazione con vettori ARS, derivati dai plasmidi killer e da pKD1  espressione di DNA eterologo Scelta del sistema di trasformazione: tipo integrativo vs replicativo Elementi di espressione regolata: -galattosidasi (lattasi)

Proteina prodotta: prochimosina (chimosina: aspartil-proteasi del caglio) Produzione in E. coli e in S. cerevisiae: insolubile e intracellulare  impossibile da utilizzare Secreta e attiva in S. cerevisiae se fusa con segnale di secrezione, ma con bassa efficienza di produzione

ELEMENTI DI ESPRESSIONE E VETTORI Isolamento di un frammento cromosomale contenente LAC4 e la parte al 5'  delezioni con Bal31  due forme del promotore: p36 e p59 ClaI XbaI SacII XbaI Gene lattasi LAC4 Bal31 SalI XbaI SacII P59: ATG + 8 bp dell’ORF Lattasi SacII XbaI SalI P36: -26 bp dall’ ATG dell’ORF Lattasi

Promotore e Terminatore : LAC4 Marcatore di selezione per lievito: Tn5 con promotore ADH1 di S. cerevisiae Trasformazione integrativa con vettori linearizzati e selezione su geneticina (G418) pUC19

Produzione di (pro)chimosina in K. lactis (milk clotting units/ml) Vettore Promotore Segnale di secrezione Intracellulare Secreta pGB901 LAC4 p36 Nessuno 0.3 1.1 pGB902 LAC4 p59 0.5 2.2 pGB904 Chimosina 5.0 94.6 pGB905 AG* 0.4 27.4 pGB906 Disegnato Nd 13.1 pKS105  Factor (Sc) 3.0 104.2 * Aspergillus awamori

Identificazione chimosina: saggi enzimatici (attivazione zimogeno con acidi e coartazione della caseina) immunologici (anticorpi anti-chimosina) PRODUZIONE INTRACELLULARE Vettori pGB901 e pGB902: sequenza codificante della prochimosina (cDNA) senza segnali di secrezione (in pGB902 fusa con aa di Lac4p). Il prodotto e' SOLUBILE e ATTIVO. Sorprendentemente si trova sia nel citoplasma che nel supernatante, viene cioe' anche secreto. In S. cerevisiae il prodotto è invece insolubile. AG leader: MetSerPheArgSerLeuAlaLeuSerGlyLeuValCysThrGly LeuAla AsnValIleSerLysArgVal Leader sintetico: MetAlaPheArgSerLeuAlaLeuSerGlyLeuSerCys GlyAlaLeuAlaAlaGlnVal In rosso bold la parte copiata dall'amiloglucosidasi; in blu corsivo gli aa trovati piu' di frequente nelle posizioni -6  +2 intorno al sito di taglio () della presequenza; in rosa gli aa dell'amiloglucosidasi fusi con la prochimosina)

PRODUZIONE EXTRACELLULARE Provati differenti sequenze segnale per la secrezione utilizzando come vettori di base pGB902 (fusioni con aa di Lac4p) o pGB901. Presequenze utilizzate: Chimosina (omologa alla proteina)  factor di K. lactis (omologa all'ospite, dato non riportato)  factor di S. cerevisiae (eterologa) amiloglucosidasi (AG; eterologa, fungigna) sintetica (figura; AG+disegnata) Tutte le presequenze dirigono efficacemente la secrezione e aumentano la produzione (tabella).

Paragone K. lactis vs S. cerevisiae Vettore integrativo pKS100: Gene prochimosina Promotore GAPDH Leader  factor Produzione di prochimosina (milk clotting units/ml) ceppo lievito intracellulare secreta AB110 S. cerevisiae <0.25 <1.0 AB110::pKS100 15.5 2.3 KRN K. lactis KRN::pKS100 12.0 333.0

PRODUZIONE SU LARGA SCALA Utilizzato il ceppo CHY1 (ceppo SL56 trasformato con pKS105). Verificate la stabilita' mitotica (figura) e strutturale dell'integrazione (Southern blotting: assenza di riarrangiamenti). Scaling up del processo in fermentatori da 3000, 12000 e 41000 litri. Il prodotto di fermentazione (nel supernatante) e' stato controllato e paragonato alla rennina di vitello commerciale, nei seguenti test: mappatura peptidica sequenza N terminale stabilita' termica attivita' coagulante sul latte attivita' idrolitica sulla caseina (profilo di idrolisi)

Anticorpi anti-chimosina Western blotting con Anticorpi anti-chimosina chimosina Stabilità della produzione da CHY1 (7 colture sequenziali: totale 45 duplicazioni) prochimosina

PUNTI DI DISCUSSIONE La prochimosina intracellulare e' solubile e attivabile; legami S-S corretti in K. lactis ma no in S. cerevisiae (la prochimosina intracellulare e' insolubile e associata a membrane e/o parete). La prochimosina senza presequenze e' ugualmente secreta. Problemi annessi: Lisi cellulare? Stabilita' differente dentro o fuori dalla cellula? Turnover proteico elevato nella cellula? Le sequenze segnale: tutte aumentano l'efficienza di produzione e secrezione, ma con livelli un po' differenti. Efficacia del segnale?

La chimosina prodotta e' usata per produzioni di formaggi Confronto con S. cerevisiae: anche con la sequenza segnale di Suc2p (invertasi) solo il 10% della prochimosina e' secreto (l'enzima e' pero' solubile e attivo). Livelli di secrezione paragonabili a K. lactis solo in seguito a mutagenesi e selezione di ipersecretori La chimosina prodotta e' usata per produzioni di formaggi Van den Berg et al. Kluyveromyces as a host for heterologous gene expression: expression and secretion of prochymosin. BIO/Technology 8, 135-139 (1990) non disponibile on-line