Concetti di base dell'ingengneria genetica tradizionale: Vettore: plasmide/fago di E. coli che "porta" il DNA di interesse Amplificazione del DNA in vivo: incremento della quantita' di DNA plasmidico in E. coli per permetterne la manipolazione in vitro Manipolazioni in vitro degli acidi nucleici (DNA, RNA) con biocatalizzatori: uso di enzimi di modificazione del DNA e RNA (enzimi di restrizione, ligasi, fosfatasi, chinasi etc.) Trasformazione di organismi (cellule + DNA) e selezione dei trasformanti Metodologie disponibili/necessarie Estrazione e purificazione acidi nucleici (DNA, RNA) Estrazione e purificazione enzimi (livello commerciale) Modificazione degli acidi nucleici Trasformazione di E. coli Selezione dei trasformanti Analisi del DNA ricombinante

Idrolisi DNA sito-specifica Frazionamento DNA Gli enzimi dell’ingegneria genetica Enzima Attività Uso Restrizione Idrolisi DNA sito-specifica Frazionamento DNA Fosfatasi Idrolisi fosfato DNA Inattivazione estremità Chinasi Fosforilazione DNA al 5’ Attivazione estremità Ligasi Formazione legame 3’P5’ nel dsDNA Assemblaggio molecole dsDNA DNAasi Idrolisi DNA (sd, ss, eso/endonucleasi) Frazionamento casuale/progressivo RNAasi Idrolisi RNA DNA polimerasi Sintesi ssDNA da templato (anche RNA)+primer cDNA, PCR, blunting, Nick translation RNA polimerasi Sintesi RNA Trascrizione in vitro Metilasi Metilazione DNA Protezione DNA Ricombinasi Integrazione DNA sito-specifica Assemblaggio dsDNA

Gli enzimi di restrizione Esistono sistemi di difesa batterica nei confronti delle infezioni virali: enzimi di “restrizione” che tagliano il DNA virale in punti precisi riducendolo a frammenti inattivi. Questi sistemi comprendono anche enzimi che metilano alcune delle basi presenti nella sequenza nucleotidica bersaglio dell’enzima di restrizione. La sequenza con le basi metilate non sono più riconosciute ed il taglio non viene effettuato. Nel 1970 Hamilton Smith ha isolato il primo enzima che taglia il DNA a livello di una sequenza nucleotidica specifica .

Le DNA ligasi: assemblaggio di frammenti di DNA con estremità ‘compatibli’ Estremità ‘appiccicose’ ed estremità piatte

Fosfatasi e chinasi

Sintesi del cDNA: Reverse transcriptase Transferase DNA polymerase

I plasmidi sono elementi a DNA circolare a doppio filamento presenti in molti batteri. Il plasmide pBR322 è il primo plasmide artificiale costruito utilizzando frammenti di due plasmidi naturali di E.coli e un trasposone.

Un notevole numero di vettori variamente ingegnerizzati per ottimizzare procedure di screening e identificazione degli eventi di clonaggio positivo.

Marcatore genetico: marcatori auxotrofici (es URA3, LEU2, HIS3, TRP1 etc) resistenza ad antibotici (es geneticina: aminoglicoside fosfotrasferasi del trasposone batterico Tn5) resistenza a metalli (es Cu+2 o Cd+2: metallothioneine)

Vettori replicativi per lievito: vettori ARS (autonomously replicating sequences) vettori centromerici vettori episomali vettori di espressione

Vettori di espressione: Integrativi Centromerici Multicopia-episomali

ASPETTI EVOLUTIVI 10 plasmidi trovati in 2500 ceppi analizzati (500 specie) omologia di sequenza assente (tranne nei geni A) analogie strutturali dei plasmidi (geni A, B, C e D ed altri elementi: posizione ORI, Inverted Repeats, sequenze ripetute dei loci di stabilità) analogie funzionali

IL PLASMIDE 2m DI S. cerevisiae

IL PLASMIDE pKD1 di K. lactis Funzioni plasmidiche: replicazione ripartizione ricombinazione

IDENTIFICAZIONE DELL’ ORIGINE DI REPLICAZIONE: Vettore integrativo + sequenze del plasmide

FUNZIONE DEI GENI: Inattivazione per inserzione

IDENTIFICAZIONE DEL locus DI STABILITA’: Vettore replicativo + sequenze del plasmide

RICOMBINAZIONE e NUMERO di COPIE pS13 Vector YIp5 (pKA) (pKC) (pKB) Vettore Copie per Cellula cir0 (%) cir+ pS13 18 100 74 pKA 7 79 66 pKB 13 5 59 pKC 15 4 78

Vettori di espressione basati su pKD1: Stabilità Elevato numero di copie