PRODOTTI FARMACEUTICI (proteici) DA BESTIAME TRANSGENICO Prima proteina ricombinante prodotta in E. coli: somatostatina (1977) Prima con licenza Food & Drug Admin.: insulina (1982) Prima proteina ricombinante prodotta in lievito: interferone (1981) Prima con licenza FDA: antigene di superficie del virus dell’epatite B (1982) Nel 1988 viene riportata l’espressione del fattore IX del sangue in mammella di pecora Da allora si registra (TABELLA 1) la produzione in latte di Animali Domestici Transgenici (ADT) di diverse proteine umane, molte ad un livello produttivo commercialmente valido (> 1 mg/ml) Al 1998 sono tre le Proteine Ricombinanti (PR) da animali transgenici impiegate in prove cliniche

Scelta del sistema per la produzione di PR Possibilità di scalatura Produzione totale annua Tempi di ottimizzazione del processo Fedeltà (strutturale e funzionale) del prodotto

Perchè ADT? Rinnovabilita’ della fonte di produzione Sicurezza del prodotto per la salute dell’uomo rispetto alla purificazione da tessuti/organi umani (trasmissione di malattie) Alcuni aspetti legati alla produzione di PR in ADT: Aspetti socio-economici Economicita’ del prodotto (es. la fattoria transgenica produce a costi piu’ bassi del fermentatore a cellule di mammifero. Vedi tabella) Commerciabilita’ del prodotto Sicurezza e regolamentazione della produzione Aspetti scientifici/tecnologici Ottenimento degli ADT Modificazioni post-traduzionali Purificazione del prodotto

COME SI GENERANO ANIMALI TRANSGENICI Sistemi di generazione sviluppati in topo e utilizzati principalmente per studi di base: Tumorigenesi Sistema immunitario Modelli biomedici per malattie genetiche Gene knock-out Fattibilità per produzioni su larga scala Sistemi sviluppati in topo: Vettori retro-virali Microiniezione Trasformazione cellule staminali Trasferimento nucleare Trasformazione con YACs

Vettori retrovirali in cellule embrionali: Si effettua in vitro Semplice Integrazione del gene eterologo in singola copia Dimensione del DNA limitata

Yeast Artificial Chromosomes Il problema della dimensione del DNA eterologo e’ stato affrontato in diverse maniere. Uno e’ lo sviluppo di vettori particolarmente capaci. Ad esempio i cromosomi artificiali di lievito (YAC) sono in grado di portare fino a 2.000.000 bp, rispetto ai fagi o ai cosmidi che ne portano 50.000. I retrovirus anche meno. Sono in fase di sviluppo cromosomi artificiali per uomo e topo.

Microiniezione in pronuclei di oociti appena fecondati: Si fa in vitro Bassa efficienza (tabella)

Trasformazione di cellule staminali totipotenti (ES) da blastocisti: Si fa in vitro Trasformazione integrativa omologa, integrativa non-omologa o no integrativa Possibilità di coltivazione in vitro delle linee Possibilità di identificazione e selezione dei positivi omologhi per PCR ES non ancora individuate in bovini, ovini, suini e polli

Trasferimento nucleare: Utilizzato in zootecnia Si fa in vitro Vitalità bassa Totipotenza del nucleo trasferito

DOVE SI PRODUCE LA PR Vantaggi dell’uso della ghiandola mammaria per la produzione di PR: Fluido secreto Prodotto in quantità elevate Raccolto dall’animale senza problemi Produzione senza danni per l’animale Modifiche post-traduzionali del prodotto Purificazione da altre proteine del latte semplice Svantaggi: Lag tra nascita e lattazione Produzione discontinua Alcuni prodotti dannosi per l’animale Fluidi biologici raccoglibili per la produzione di PR: Latte Sangue Urina Liquido seminale Uova

METODOLOGIE TRANSGENETICHE Principi di base per l’ottenimento del ADT: Costruzione del vettore per l’espressione del gene eterologo con promotori latte-specifici Introduzione del DNA in embrioni fecondati (metodo della microiniezione) Breve coltura in vitro delle cellule trasfettate Trasferimento dell’embrione in femmine pronte per la gestazione Biopsia per identificare gli individui transgenici di prima generazione (detti “founders”) Le femmine sono pronte per la produzione nel periodo dell’allattamento (dopo il parto), ma la lattazione si puo’ indurre anche ormonalmente a prescindere dalla gravidanza. I maschi transgenici vengono invece utilizzati l’accoppiamento e la procreazione di altri ADT L’espressione di geni eterologhi in ADT e’ stata ottenuta in Vacca Pecora Capra Coniglio Maiale L’uso di conigli e maiali e’ vantaggioso per quanto riguarda il numero di prole e i tempi di gestazione (TABELLA 2)

Nel BOX 2 si riporta la dimensione della mandria di ADT necessaria a coprire un determinato fabbisogno annuale di PR

Un passaggio critico nella generazione degli ADT e’ l’efficienza molto bassa di integrazione del DNA esogeno nel genoma della cellula da trasfettare (TABELLA 3). Invece di trasfettare gli embrioni per microiniezione si puo’, in alternativa, utilizzare dei metodi piu’ efficienti: 1. Trasfezione diretta dell’ovocita in vitro, fecondazione dell’ovocita in vitro, trasferimento degli ovociti fecondati in femmine per la gestazione 2. Uso di vettori retrovirali difettivi. Efficaci ma con delle controindicazioni: Dimensioni dell’inserto limitate Possibili interferenze degli elementi retrovirali sull’espressione del gene eterologo Rischio biologico Regolamentazioni e restrizioni per l’uso

RECENTI SUCCESSI Produzione di proteine grandi (fattore di coagulazione VIII) utilizzando il cDNA Produzione di proteine piccole (calcitonina). Nel caso di proteine particolarmente attive si possono far produrre delle proteine di fusione (inattive nell’ ADT), che vengono poi isolate e idrolizzate nella forma attiva in vitro nel processo downstream Modificazioni post-traduzionali: in vari esempi si e’ ottenuta una corretta glicosilazione della PR Indirizzamento nei compartimenti cellulari: si e’ ottenuta la secrezione di proteine normalmente non secrete (e viceversa) Assemblaggio di complessi multimerici per co-trasfezione di geni differenti Le problematiche tecniche attuali comprendono l’ottimizzazione dell’espressione per avere alta efficienza di produzione, bassi costi e tempi piu’ corti per le prove cliniche. A tale scopo si cerca di massimizzare l’espressione del gene e quindi la produzione di ADT. Per quanto riguarda l’espressione del gene eterologo, e’ noto che dipende dal promotore, dal dosaggio genico (numero di copie) e dalla posizione dell’integrazione.

PROMOTORI L’espressione dei geni, e quindi l’attivazione dei promotori, e’ legata al tempo (timing) e al luogo (tessuto). L’espressione di geni per PR mirata alle ghiandole mammarie e al periodo di allattamento utilizza quindi promotori latte-specifici. Quasi tutti sono inter-specifici. Si riportano alcuni esempi (BLG, caseine, WAP etc). ENHANCERS L’espressione e’ spesso ottimale se si usa DNA genomico invece che il cDNA: effetto dovuto a enhancers intronici. Il problema dell’uso del DNA genomico e’ la sua dimensione elevata. Si possono reinserire sequenze introniche con nota funzione di enhancer nel cDNA, in modo da contenere al minimo la dimensione. Si riportano diversi casi di effetti trascrizionali ad opera di sequenze introniche (eritropoietina, antitripsina, fattore VIII). In alcuni casi si puo’ avere un aumento dell’espressione se si cotrasfetta il gene di interesse con geni altamente espressi. Questo effetto dipende dal fatto che l’integrazione dei due DNA avviene spesso nello stesso punto e si puo’ avere un effetto delle sequenze enhancer del gene altamente espresso sul gene di interesse vicino.

DIPENDENZA DALLA POSIZIONE DI INTEGRAZIONE La posizione dell’integrazione influisce fortemente l’espressione tramite differenti elementi regolativi: Presenza nel locus di integrazione di repressori cis Assenza nel locus di integrazione di opportuni enhancers Struttura della cromatina nel locus non permissiva ai fattori di espressione Alcuni geni contengono delle sequenze che conferiscono indipendenza dal luogo di integrazione all’espressione del gene stesso. Questi elementi si chiamano Locus Control Regions (LCR). LCR sono stati identificati in alcuni clusters genici (es della -globina e dell’ormone della crescita). Sono stati analizzati a livello molecolare con un certo dettaglio, ma bisogna ancora verificare se funzionano su geni eterologhi nelle ghiandole mammarie. Altri elementi che conferiscono indipendenza dalla regione di integrazione sono le Matrix-Attachment Regions (MAR). Si trovano alle estremita’ di certi domini genetici e hanno la capacita’ di proteggere le regioni che delimitano dagli effetti strutturali dalla cromatina.

CELLULE STAMINALI Le cellule staminali di embrione (ES) sono cellule non ancora differenziate e coltivabili in vitro. Possono essere indotte al differenziamento se combinate con embrioni precoci Si possono manipolare geneticamente in vitro Si possono quindi indirizzare selettivamente le integrazioni transgeniche in opportuni loci genetici Finora solo le ES di topo sono risultate valide e stabili in questo tipo di esperimento Pochi casi finora descritti di ADT ottenuti secondo questo procedimento Il transgene sara' presente solo in quei tessuti che originano dalla ES trasformata Ai fini produttivi di PR, i tessuti che devono essere transgenici saranno la mammella (per la produzione) e i tessuti germinali (per la riproduzione dell'ADT)

PROCESSI Punti importanti per la fattibilita' di un processo: Raccolta del primo latte per la caratterizzazione preliminare del prodotto. La fattibilita' del processo e' legata alla possibilita' reale di utilizzo del prodotto su larga scala e quindi alla possibilita’ di scalare il processo. Purificazione del prodotto per le prime prove cliniche. Il risultato delle prove cliniche e' fondamentale e bisogna avere a disposizione una quantita' sufficiente di prodotto. Un modo per aumentare la resa in prodotto e' la riduzione del numero di animali NON transgenici prodotti nel processo e l'aumento degli ADT. A questo scopo si possono utilizzare gli stessi procedimenti per riproduzione assistita di animali selezionati dei metodi classici di allevamento: Induzione di superovulazione Inseminazione artificiale Coltura e manipolazione in vitro degli embrioni Divisione e trasferimento degli embrioni

TRASFERIMENTO NUCLEARE Trasferimento del nucleo (NT) da cellule donatrici a ovociti enucleati Stimolazione artificiale della nuova cellula allo sviluppo dell'embrione Impianto dell'embrione in femmina per la gestazione Questo metodo di "clonaggio" e' gia' da tempo utilizzato in zootecnia con cellule donatrici non transgenici embrionali.

Per ottenere ADT produttori, il donatore di nucleo deve essere di tipo femminile. In questo modo si possono teoricamente generare numerosi ADT per volta, utilizzando come donatrici cellule transgeniche di un produttore particolarmente pregiato. Inoltre la mandria di produttori "clonali" si puo' ingrandire a piacimento senza aspettare i tempi di generazione dell'animale. Bisogna avere l'accortezza di conservare le cellule embrionali da cui si e' generato il produttore pregiato ed utilizzarle in seguito come donatori. Finora sono state utilizzate come donatrici cellule embrionali o cellule di linee primarie (cellule non immortalizzate), che sono poco coltivabili in vitro. Il metodo puo' essere di molto migliorato usando cellule donatrici piu' stabili, analizzabili e caratterizzabili in vitro. Esempio di Dolly; la cellula donatrice e' somatica. Tra i problemi del NT sono non trascurabili quelli dello stato di salute della progenie: Sottosviluppo Anomalie fisiche generiche Basse frequenze di gravidanze completate

PROBLEMATICHE RELATIVE ALLA PRODUZIONE ALL’USO DI PROTEINE RICOMBINANTI DA ANIMALI TRANSGENICI Problemi di produzione: molte tecniche ed applicazioni sono brevettate (produzione nel latte, trasferimento nucleare etc) Problemi etici: l’animale sofferente è inaccettabile da scienziati, pubblico e agenzie di controllo Problemi ambientali: percezione negativa del pubblico per contaminazione del cibo e ambiente ma, diversamente dalla pianta, l’animale non entrerebbe nel ciclo alimentare. Percezione negativa del pubblico a seconda dell’origine della PR (es. da urina o liquido seminale) Rudolph NS Biopharmaceutical production in transgenic livestock (1999) Trends in biotechnology 17:376-374 Bibliografia aggiuntiva: Dyck MK et al. Making recombinant proteins in different animals-different systems, different applications (2003) Trends in biotechnology 21:394-399 Glick BR e Pasternak JJ Biotecnologia molecolare - Zanichelli