Clonaggio funzionale Clonaggio posizionale Conoscenza proteina Malattia genetica Determinazione sequenza amminoac. Mappatura genetica con marcatori polimorfici Deduzione sequenza nucleotidica Identificazione cloni genomici che coprono il sito mappato Sintesi sonda oligonucleotidica Ricerca del gene (varie tecniche) Isolamento clone di cDNA Deduzione della struttura aminoac. Isolamento clone genomico Ricerca mutazioni nucleotidiche Caratterizzazione clone genomico Ricerca funzione proteica Ricerca delle mutazioni

METODI DI CLONAGGIO

CLONAGGIO ATTRAVERSO VETTORE

ENZIMI DI RESTRIZIONE

DIGESTIONE MULTIPLA E CLONAGGIO

CLONAGGIO, TRASFORMAZIONE E SELEZIONE SINGOLI CLONI

Numero di cloni necessario per costruire librerie genomiche N = ln (1 – P) / ln (1- a/b) a = dimensione media del frammento b = totale del genoma da clonare P = probabilità che qualunque frammento sia clonato Specie Dimensioni del genoma (bp) Numero di cloni Frammenti Frammenti da 17 kb da 35 kb E. coli 4,6 x 106 820 410 S. cerevisiae 1,8 x 107 3225 1500 D. melanogaster 1,2 x 108 21500 10000 Riso 5,7 x 108 100000 49000 Uomo 3,2 x 109 564000 274000 Rana 2,3 x 1010 4053000 1969000

STIMA DELLA RELAZIONE TRA DISTANZA GENETICA E FISICA Stima della distanza genetica totale (in cM) nella specie umana: somma della lunghezza totale dei cromosomi ottenuta dalla mappatura genetica con marcatori polimorfici Nel maschio = 2644 cM Nella femmina = 4481 cM Per 3000 Mb = 3 x 10 9 bp di genoma Maschio 1 cM = 1.13 Mb = 1.13 x 106 bp Femmina 1 cM = 0.67 Mb = 0.67 x 106 bp Media : 1 cM = 0.9 Mb = 0.9 x 106 bp

MAPPATURA FISICA COSTRUZIONE DI LIBRERIE GENOMICHE A PARTIRE DA DNA OTTENUTO DA: DNA GENOMICO TOTALE IBRIDI SOMATICO-CELLULARI PANNELLI DI IBRIDI MONOCROMOSOMICI PANNELLI DI IBRIDI CON CROMOSOMI DELETI IBRIDI DA RADIAZIONE SINGOLI CROMOSOMI ISOLATI CON CITOMETRIA A FLUSSO

COSTRUZIONE DI UNA LIBRERIA DI DNA GENOMICO TOTALE

SEPARAZIONE DI CROMOSOMI CON CITOMETRIA A FLUSSO

LIBRERIE DI GENOMA UMANO VETTORI DI CLONAGGIO DIMENSIONI DELL’INSERTO Vettori plasmidici standard 0 - 10 Kb Vettori lambda 10 - 20 Kb Vettori cosmidici 30 - 44 Kb Vettori BAC (cromosomi artificiali batterici) fino a 300 Kb Vettori YAC (cromosomi artificiali di lievito) 0.3 - 2.0 Mb Libreria di DNA genomico in termini di genoma-equivalenti 1 genoma equivalente: 3000 Mb/40 Kb = 75000 cloni indipendenti

ASSEMBLAGGIO DEI CLONI IN CONTIGUI ATTRAVERSO: 1) walking cromosomico: - con cloni interi (e soppressione di sequenze ripetitive); - con le estremità dei cloni 2) fingerprinting per identità di: - mappa di frammenti di restrizione - presenza DNA ripetitivo in frammenti di restrizione, - prodotti PCR compresi tra elementi ripetuti (IRE, intersperse repetitive elements, es. Alu) 3) contenuto di Sequence Tagged Site (STS) (Siti contrassegnati da una sequenza)

DIGESTIONE PARZIALE DEL DNA E PRODUZIONE DI CLONI CON FRAMMENTI CHE SI SOVRAPPONGONO

CHROMOSOME WALKING

CHROMOSOME WALKING

FINGERPRINTING PER MAPPA DI FRAMMENTI DI RESTRIZIONE Presenza nei diversi cloni di frammenti di restrizione della stessa dimensione

FINGERPRINTING DEI CLONI PER PRESENZA DI DNA RIPETITIVO IRE = elementi ripetuti intercalati, es sequenze Alu: inter Alu-PCR

ASSEMBLAGGIO DI CLONI MEDIANTE ANALISI DEL CONTENUTO DI SEQUENCE TAGGED SITE (STS) (SITI ETICHETTATI DA UNA SEQUENZA) STS = sequenza a singola copia amplificabile con PCR La presenza del prodotto PCR di peso molecolare atteso rivela la presenza di quella STS all’interno di un clone

METODI PER L’ANALISI DEI CLONI GENOMICI PER ORDINARLI IN CONTIGUI - Distribuzione dei cloni in piastre da microtitolazione per produrre griglie ordinate - Produzione di filtri con i singoli cloni da utilizzare per analisi con ibridazione - Produzione di pool di DNA di cloni e selezione attraverso PCR specifiche

- Piastra agar con cloni ricombinanti -Trasferimento delle singole colonie in piastre da microtitolazione con pozzetti con terreno (96 pozzetti per microtiter) Produzione filtro corrispondente

Libreria specifica del cromosoma 6 con cloni ordinati su griglia - Piastra di agar 22 x 22 cm con cloni ricombinanti Trasferimento delle singole colonie in piastre di microtitolazione con pozzetti con terreno (96 pozzetti per microtiter) - Trasferimento delle singole colonie in piastre da microtitolazione ad alta densità 96 x 4 = 384 pozzetti per microtiter - Trasferimento automatizzato su filtro 54 microtiter x 384 pozzetti = 20736 cloni = 4 genomi equivalenti

Screening di intere librerie genomiche con PCR su pool di DNA

Analisi di una intera libreria genomica tramite saggi di PCR Master pool Ogni Master pool = 9 piastre x 96 pozzetti = 864 DNA di YAC - Pool di ogni singola piastra delle 9 Pool di colonna es: da A1 a H11 Pool di riga es: da A1 a A12 Scomposizione nelle singole piastre della master pool 12: PCR positiva nella piastra G Riga E Colonna 5 Individuazione con PCR della/e master pool: 5, 12 e 33

ALLINEAMENTO DI YAC PER CONTENUTO DI STS PCR specifica dal DNA di ogni clone

ALLINEAMENTO DI YAC PER CONTENUTO DI STS

CLONAGGIO POSIZIONALE: UTILIZZO DEI MARCATORI ASSOCIATI GENETICAMENTE PER COSTRUZIONE DI UN CONTIGUO DI CLONI GENOMICI