ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE Identificate negli anni ‘70 Enzimi che tagliano il DNA in maniera sequenza-specifica Sistema di riconoscimento di DNA estraneo dei batteri - sistema “immunitario” batterico
Esempi di sequenze riconosciute da alcuni enzimi di restrizione
ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE - STRUTTURA
ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE - STRUTTURA
TAGLIO DEL DNA CON ENZIMI DI RESTRIZIONE Riconoscimento della sequenza Taglio asimmetrico - estremità coesive Taglio centrale estremità “blunt”
TAGLIO DI DNA GENOMICO CON ENZIMI DI RESTRIZIONE Produzione di frammenti di dimensioni diverse Frammenti estremamente numerosi
PERCHE’ TAGLIARE IL DNA CON ENZIMI DI RESTRIZIONE Ogni gene può essere presente in uno o più frammenti di DNA Mediante l’analisi dei frammenti specifici è possibile identificare alterazioni a carico di DNA cause di malattie genetiche
TIPI DI ALTERAZIONI CHE DANNO ALTERAZIONI DI FRAMMENTI DI RESTRIZIONE Assenza di un frammento Delezioni di un pezzo di DNA Alterazioni di dimensioni di un frammento Duplicazioni di un pezzo di DNA Comparsa o scomparsa di un nuovo frammento Traslocazioni, mutazioni che causano la comparsa /scomparsa di un sito di restrizione
COME ANALIZZARE IL DNA TAGLIATO CON ENZIMI DI RESTRIZIONE Separazione dei frammenti Gel di agarosio Trasferimento dei frammenti su un supporto più maneggevole Southern blot Ibridizzazione con sonde specifiche Autoradiografia
Gel di agarosio E’ un polimero lineare La visualizzazione avviene grazie alla colorazione con etidio bromuro Tale colorante contiene un gruppo planare che si intercala tra le basi del DNA dando origine ad un legame che aumenta la quantità di fluorescenza se confrontato con quello libero La distanza della banda rispetto al punto di deposizione sul gel è inversamente proporzionale alla lunghezza del frammento amplificato
Gel Electrophoresis
SOUTHERN BLOT Inventato all’inizio degli anni ‘80 da Ed Southern Trasferimento del DNA separato elettroforeticamente su un supporto solido (nylon, nitrocellulosa) mediante capillarità
SOUTHERN BLOT
SOUTHERN BLOT Parametri importanti Tampone deve passare attraverso il gel e non lateralmente (corto-circuito) Forza ionica adeguata Supporto e carta pre-trattati Assenza di bolle d’aria Legame del DNA al filtro mediante UV o “baking”
SOUTHERN BLOT
STRINGENZA
IBRIDIZZAZIONE Parametri importanti Probe Privo di sequenze ripetute Privo di sequenze omologhe (pseudogeni) Stringenza dell’ibridizzazione Temperatura Forza ionica nel buffer di ibridizzazione Forza ionica nei buffer di lavaggio
SOUTHERN BLOT
ESPOSIZIONE Parametri importanti Perfetta adesione del filtro alla lastra Assenza di residui di tampone sul filtro Durata dell’esposizione Uso di Phosphorimager
SOUTHERN BLOT Analisi di delezione
SOUTHERN BLOT Analisi di espansione
Amplification Fragment Length Polymorphisms Restriction digestion (AmpFLPs) (1) Normal DNA (2) Mutant DNA PCR Product Restriction digestion analysis 1 2 3 SM