Genetica medica ADI-1 genetica online e clinica barbara.pasini@unito.it Dip. di Genetica Biologia e Biochimica Genetica medica oncologica ASO S. Giovanni Battista - Torino IRCC - Candiolo

Le malattie genetiche : Malattie causate in modo esclusivo o parziale da un difetto del patrimonio ereditario: difetto nel numero o struttura dei cromosomi -> malattie cromosomiche difetto nella struttura o funzione di un gene -> malattie geniche (monogeniche) (mutazioni del DNA nucleare e mitocondriale) coinvolgimento di una serie di geni localizzati in una stessa regione genomica (riarrangiamento) -> malattie genomiche

Le malattie genetiche : effetto di modificazioni chimiche e strutturali del DNA in grado di alterare l’espressione di un gene o di un gruppo di geni -> malattie epigenetiche (difetti di imprinting) effetto dell’interazione tra geni e ambiente -> malattie multifattoriali o complesse

+ 179 March 20, 2005

+ 186 March 24, 2004

April 19, 2006 March 20, 2005 March 24, 2004

Vengono proposti due alberi genealogici con feocromocitoma bilaterale e/o famigliare commentando gli aspetti suggestivi di predisposizione (rarità del tumore, bilateralità, precoce età di insorgenza associazione con altre lesioni tipo sorella del probando del secondo pedigree deceduta nel post operatorio di intervento chirurgico per l’asportazione di non meglio specificato angioma midollare)

Perché occuparci di questi casi da un punto di vista genetico ? tumori giovanili, multipli, bilaterali fanno sospettare una predisposizione i soggetti già malati potrebbero sviluppare altri tumori altri membri della famiglia potrebbero ammalarsi parenti sani ma preoccupati di potersi ammalare in futuro potrebbero non avere ereditato il difetto genetico la “causa” genetica (biochimica) di una malattia potrà in futuro essere corretta ?! diagnosi corretta gestione clinica identificazione dei portatori identificazione dei non portatori ricerca

Ricerca basata sul “sintomo” Feocromocitoma famigliare Feocromocitoma + angioma midollare National Center for Biotechnology Information NCBI : http://www.ncbi.nlm.nih.gov Pubmed , OMIM > VHL, RET, SDH-B, SDH-C, SDH-D Gene Test http://www.geneclinics.org/ > Gene Review Cancer Prone Diseases http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer/ Viene proposta una ricerca in medline basata sul sintomo in Pubmed e OMIM da cui si deriva il sospetto diagnostico di VHL, MEN2A e mutazioni SDH con navigazione su Gene Test e Cancer Prone Diseases per avere in breve l’elenco delle manifestazioni di malattia.

MEN2 MEN1 VHL SDH genes parathyroid medullary hyperplasia thyroid carcinoma MEN1 pheochromocytoma para- ganglioma neuroendocrine pancreatic tumors retinal angiomas CNS haemangioblastomas renal cell carcinomas Schema di diagnosi differenziale. pituitary adenoma duodenal gastrinomas carcinoids exc. VHL SDH genes

Casi di feocromocitoma Predisposizioni ereditarie allo sviluppo del feocromocitoma e paragangliomi extra-surrenalici Casi di feocromocitoma isolato , non-sindromico (surrenalico , extra-surrenalico) 11% VHL (per lo più mutazioni missenso) 5% RET (per lo più mutazioni esoni 11 e 13) 4.5% SDHB 4% SDHD Tot 24% (70% <10 yr, 51% < 20 yr; 39% < 30 yr, 27% < 40 yr, 18% < 50 yr) (80% se multifocale)

- a 42 anni: feocromocitoma bilaterale Paziente di anni 43. - a 42 anni: feocromocitoma bilaterale - non altre manifestazioni cliniche di VHL (fondo oculare negativo, RM encefalo e midollo negativa, TC addome negativa) Genitori deceduti: -  madre a 71 anni per emorragia cerebrale -  padre a 65 anni per coma diabetico Una sorella deceduta a 31 anni per complicanze post-operatorie di intervento neuro-chirurgico per “angioma midollare”. Ci concentriamo sul secondo caso dove possiamo porre una diagnosi di sospetto per VHL.

Impostazione del test genetico Ricerca di mutazioni e delezioni gene VHL Se negativo, analisi RET e SDH-B, SDH-C, SDH-D Acquisizione della sequenza genomica del gene VHL (Entrez Gene, Ensemble: www.ensembl.org) ricerca di mutazioni puntiformi: PCR e sequenza ricerca di delezioni genomiche Stabiliamo un programma di lavoro. Andiamo ad acquisire da Entrez Gene la sequenza depositata del cDNA di VHL (vedi file word sequenze VHL pag1 e la confrontiamo con il clone genomico da Ensemble: verifichiamo le giunzioni introne esone per disegnare i primers intronici necessari al sequenziamento diretto del gene (pag2 del file di word).

PCR Ciclo 1 Ciclo 2 Denaturazione 95°C Appaiamento inneschi Sintesi del DNA 72 °C (Taq polimerasi) Ciclo 1 PCR Ciclo 2 Sintesi del DNA Appaiamento inneschi Spiegazione sul funzionamento della PCR prima con le dia 6 e 7 poi con il filmino dell’animazione.

PCR : Reazione a Catena della Polimerasi N° cicli 1 3 10 15 20 25 30 N° sequenze bersaglio 2 256 8192 262.144 8.388.608 268.435.456 Per l’analisi di una digestione con enzimi di restrizione tale da poter essere visibile in elettroforesi occorre ~1g di DNA. Se vi sono ~5 pg di DNA/cellula umana (5x10-12g) allora ~1 g of DNA potrebbe essere isolato da 200.000 cellule ma avremmo un miscuglio di tutti i geni. In 1  g di DNA genomico, una copia singola di un esone (300 bp) equivarrebbe a ~0.1 pg di DNA. Questo 0.1 pg di DNA potrebbe essere amplificato mediante PCR producendo 0.8  g in 25 cicli e 27  g in 30 cicli.

Sequenziamento del DNA (1): strutture dei nucleotidi Spiegazione sul funzionamento del sequenziamento diretto prima con le dia 8-10 poi con filmino con animazione.

Sequenziamento del DNA (2): il metodo di Sanger Il contenuto di ciascuna provetta viene caricato in 4 pozzetti separati di un gel di poliacrilammide * Indica il primer (lungo 15 nucleotidi) ** I dNTP sono ad una concentrazione 100 volte superiore di quella dei ddNTP in ciascuna provetta

Sequenziamento del DNA (3): il metodo di Sanger pozzetti autoradiogramma Si legga la sequenza man mano sintetizzata dal basso verso l’ alto. Il nucleotide G è il più vicino al primer (estremità 5’) mentre il nucleotide T è all’estremità 3’.

361G>A Caso indice: sequenza “senso” (forward) Caso indice: sequenza “anti-senso” (reverse) Risultato del sequenziamento del caso proposto: mutazione missenso di difficile interpretazione. 541 CACAGCTACCGAGGTCACCTTTGGCTCTTCAGAGATGCAGGGACACACGATGGGCTTCTG 110 -H--S--Y--R--G--H--L--W--L--F--R--D--A--G--T--H--D--G--L--L-

codifica mutazione c.365G>A (p.D121N) GAT>AAT: Asp121Asn Acido Aspartico -> Asparagina aa acido aa polare COOH | 2HN -- CH CH2 COOH | 2HN -- CH CH2 CO--NH2 DB SNPs: Segnalato in precedenza SNP D121G senza info DB mutazioni: The Human Gene Mutation Database : http://archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmd0.html -> report 1994 D121G in un paz. con feocromocitoma Commento su come interpretare il significato biologico di una mutazione missenso: controlliamo cosa è depositato in HGMD e controlliamo se si tratta di uno SNP. Lasciamo un attimo in sospeso la cosa e passiamo al secondo caso.

VHL protein beta-domain alpha-domain 7 stranded b sandwich: aa 63-154 (HIF1a binding: aa 67-117) H4: aa 193-204 Linker: aa 189-194 alpha-domain aa 155-192 H1 – H2 – H3 Linker: aa 154-156 polar interface between a and b domains Stebbins CE et al Science 1999

VHL – a b interface Polar interface between alpha and beta domain Hydrogen bonds involving: a amino acids: H3 Asp187, Leu188 H1 Glu160, Arg161, Gln164, Arg167 b amino acids: L6 Asp121, Thr124, Asp126 L2 Arg82 Sottolineati: BASICI Italico: ACIDI Stebbins CE et al Science 1999

Feocromocitoma non sindromico giovanile in due fratelli Programma: ricerca di mutazioni RET e SDH se negativo: analisi VHL Il primo step del programma dà un risultato negativo all’analisi RET e dei geni SDH

Nel frattempo cambia l’aspetto della famiglia e passiamo all’analisi VHL

467A>C Caso indice Madre E di nuovo identifichiamo una mutazione missenso 661 AATATCACACTGCCAGTGTATACTCTGAAAGAGCGATGCCTCCAGGTTGTCCGGAGCCTA 150 -N--I--T--L--P--V--Y--T--L--K--E--R--C--L--Q--V--V--R--S--L-

codifica mutazione c.467A>C (p.Y156S) TAT>TCT: Tyr156Ser Tirosina -> Serina aa idrofobico aromatico aa polare “sottile” polare COOH | 2HN -- CH CH2 OH COOH | 2HN -- CH CH2--OH DB SNPs: NON segnalati SNPs in 156 DB mutazioni: The Human Gene Mutation Database : http://archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmd0.html -> 3 report anche recenti di mutazioni: Y156D, Y156N, Y156C Sulla quale facciamo le stesse considerazioni del caso precedente. Non resta che cercare le sequenze degli ortologhi, le allineiamo in tempo reale con il Clustal (prendendole dal file di word già predisposto, vedi poi allineamento in pag. 3 del file sequenze VHL) e andiamo in SIFT a valutare la tollerabilità delle sostituzioni amino acidiche.

VHL - Elongin C interface Most relevant contact: Leu158 – Cys162 – Arg161 Hydrogen bonds: Arg82 – Arg161 – Lys159 L = Leu R = Arg K = Lys Stebbins CE et al Science 1999

Effetto delle mutazioni missenso cambiamento aminoacidico +- conservativo frequenza nella popolazione generale segregazione nell’ambito della famiglia effetto prevedibile sulla struttura/funzione della proteina (modeling) conservazione nell’evoluzione test funzionale (ev. second hit)

SIFT Sorting Intollerant From Tollerant http://blocks. fhcrc D121N con nematodi 0.13 senza nematodi 0.00 Y156S con nematodi 0.26 senza nematodi 0.22 Y156D con nematodi 0.13 senza nematodi 0.11 Y156N con nematodi 0.20 senza nematodi 0.17 Y156C con nematodi 0.11 senza nematodi 0.09 Commento sull’interpretazione del risultato con e senza nematodi. Cosa possiamo fare ancora ? Analisi di segregazione nella famiglia, analisi di LOH su tessuto tumorale per verificare la perdita dell’allele WT. Segue spiegazione del fenomeno dell’LOH.

Inattivazione di geni onco - soppressori : perdita di funzione Geni RECESSIVI entrambi gli alleli inattivati : delezioni o riarrangiamenti cromosomici mutazioni puntiformi iper - metilazione 2 mutazioni somatiche tumore sporadico 1 costituzionale + 1 somatica tumore ereditario

Gene onco-soppressore Rb Alleli Rb normali Mutazione germinale mutazione somatica mutazione somatica mutazione somatica Retinoblastomi multipli bilaterali ad insorgenza precoce Retinoblastoma unico mono-laterale

Inattivazione di geni onco - soppressori con perdita di eterozigosità (LOH) Allele 1 5 8 Allele 2 3 6 Prima mutazione: puntiforme Allele 1 5 8 Allele 2 3 6 seconda mutazione: delezione Allele 8 Allele 2 3 6

Inattivazione di geni onco - soppressori con perdita di eterozigosità (LOH) Allele 3 1 5 8 Allele 3 2 6 Allele 1 4 6 8 Allele 3 2 6 Allele 5 3 4 6 Allele 3 2 6 Tessuto sano Allele 8 Allele 3 2 6 Allele 1 8 Allele 3 2 6 Allele 5 3 Allele 3 2 6 Tessuto tumorale Loci studiati: 1 2 3 4 Caso 1 ni - - + Caso 2 + - - + Caso 3 + + - ni Sede del gene onco-soppressore