Sindromi talassemiche ed emoglobinopatie

Definizione della patologia Assenza o ridotta sintesi di una o più catene globiniche umane Classificazione clinica – gravità Classificazione genetica – tipo di catena Classificazione molecolare – tipo di mutazione AM-tbmadc

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Classificazione clinica Major (idrope fetale, b-tal major) Intermedia (b-tal interm., HbH) Portatore (a e b) Portatore silente (a e b) AM-tbmadc

STRISCIO DI SANGUE PERIFERICO (colorazione May-Grunwald-Giemsa) Soggetto normale Portatore di b-talassemia Nel portatore di b-talassemia è rilevabile: aspetto ipocromico, aniso-micro-poichilocitosi delle emazie, presenza di schistociti, emazie a bersaglio, ed emazie a lacrima. I.Bianco Silvestroni, 1998 AM-tbmadc

b-TALASSEMIA: alterazioni ematologiche AM-tbmadc

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a-talassemia: alterazioni ematologiche AM-tbmadc

Heterogeneity of hemoglobinopathies in Mediterranean b-thal alleles (47) a-thal alleles (18) -a(3.7) initiation cd ACCATG - - CATG a2 ATGACG a1 ATGGTG a2 cd 29 TC (Agrinio) a2 IVS1 (-5nt) a2/a1 cd 110 CA (Petah Tikva) a2 cd 142 TA (Icaria) a2 polyA ATAAATGA d-thal alleles 5 - CT 8/9 + G 30 C 1-1 A 1-2 A 1-2 G 1-5 C 1-5 T 1-110 A 1-116 G 1-130 C 39 T 37 A 44-C 54-T 59-A 7-C 2-705 C 2-745 G 2-843 G 2-844 A 2-850-G 2-850 C -90 T -88 A -88 T -87 G -87 T -87 A -86 A -31 C -30 A -30 C 6 - A 8 - AA 27 T 1-5 A 1-6 C 2-1 A AACAAA AATGAAA -101 T -92 T UTR +10-T + 33 G 2-844 G AATAAG -a3.7 -a4.2 -a3.7 Hb Hasharon -(a)20.5 --MED-I --MED-II -(a)5.2 --(MA) --(CL) --(CAL) -65 AG -55 TC cd 4 CT cd 27 GT Corfù –7.2 Kb Hb Lepore db-thal alleles Sardinian Sicilian Spanish Turkish Macedonian HPFH -196 Ag C T -117 Ag G A HPFH –4 HPFH –5 Structural variants HbS HbC HbD Punjab HbO-Arab AM-tbmadc

Cap Poly-A 5’ UTR 50 nucleotidi, ATG al 3’ come codone iniziale Cap= capping del precursore dello mRNA 3’ UTR 132 nucl AM-tbmadc

+ 2 enhancers a 600 – 900 bp a valle del gene TATA box CACCC box duplicato TATA ed altri box: regolatori della trascrizione che interagiscono con LCR CACCC: eritroide specifico CAAT box: MAI MUTATO!!! TATA: alcune mutazioni Enhancers e silencers: elementi regolatori implicati nello switching, studiati su mutanti delezionali di modelli di HPFH nel topo transgenico. Overespressione degli enhancers e silenziamento dei silencers per terapia genica + 2 enhancers a 600 – 900 bp a valle del gene AM-tbmadc

LCR interagisce con promoter beta formando un’ansa Siti ipersensibili a digestioni con DNAsi = consentono accesso ai siti di trascrizione LCR interagisce con promoter beta formando un’ansa Espressione beta = f(numero interazioni e stabilità) AM-tbmadc

Fattori di trascrizione del gene b-globinico GATA-1 + FOG (GATA: 2 domini Zinc-finger) NF-E2 (PLTs) EKLF (3 Zinc-finger; switch) Fattore stadio-specifico (SSP; stimola g) GATA 2 domini Zn finger Friend of GATA (FOG) NFE Nuclear Factor erythroid (Cap and collar: basic leucine zipper) importante per le piastrine EKLF: 3 Zn finger ESSENZIALE PER LO SWITCH SSP stimola gamma AM-tbmadc

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RELATIVE FREQUENCIES OF b-THALASSEMIA MUTATIONS IN WEST EUROPE AM-tbmadc Galanello et al, TIF 2003

RELATIVE FREQUENCIES OF b-THALASSEMIA MUTATIONS IN MEDITERRANEAN EUROPE AM-tbmadc Galanello et al, TIF 2003

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Delezione promotore beta – LCR interagisce con promotori gamma e delta e HbA2 aumenta (HbF variabile) AM-tbmadc

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Epidemiology of thalassemia: global estimate Carrier rate 4.9% of world populat. Total carriers 300,000,000 Newborn carriers with Hb disorders 6.1% Newborns with a major Hb disorders 2.1/1000 Affected births/year 307,000 (WHO 1998) AM-tbmadc

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Emoglobinopatie: test di laboratorio utili per l’identificazione del portatore talassemico MCH, MCV HbA2, HbF Assetto emoglobinico Metabolismo del Ferro Sintesi delle catene globiniche Analisi dei geni globinici Studi famigliari AM-tbmadc

Fenotipo “classico” del portatore di b talassemia MCV, fL 67 ± 6 MCH, pg 22 ± 2 HbA2, % 5 ± 1 Hb elettroforesi A + (F) + A2 Rapporto a/b > 1,20 AM-tbmadc

Falsi positivi: - a talassemia - a. sideropenica Limiti nell’utilizzo dei parametri eritrocitari (MCV, MCH) nella identificazione del portatore di b-talassemia Falsi positivi: - a talassemia - a. sideropenica Falsi negativi: - interazione a, b talassemia - deficit folati e B12 AM-tbmadc

Doppia eterozigosi per a e b talassemia -a/aa -a/aa MCV, fl 76.0 MCH, pg 26.0 HbA2, % 2.5 MCV, fl 72.2 MCH, pg 23.3 HbA2, % 5.6 -a/-a MCV, fl 83.2 MCH, pg 28.1 HbA2, % 6.0 AM-tbmadc

Correlazione genotipo-fenotipo Fenotipo eterogeneo per: Gravità della mutazione Interazioni (a, b, g) - db talassemia e varianti emoglobiniche Altre modificazioni genetiche ed ambientali AM-tbmadc

Effetti della co-ereditarietà di diversi alleli a-talassemici sullo MCV in soggetti portatori di b-talassemia MCV, fL HbA2, % HbA2, % aa/aa -a/aa aaND/aa -a/-a - -/aa aa/aa -a/aa aaND/aa -a/-a - -/aa (R. Galanello, 2002) AM-tbmadc

Varianti emoglobiniche e sindromi talassemiche Varianti emoglobiniche (2002) 845 (erano 202 nel 1976) Mutazioni talassemiche 336 (4,5 % eterozigoti = 250.000.000 world-wide) Emoglobinopatie con fenotipo talassemico 43 Memo: 307.000 nati/y con 1 gene globinico anomalo (alfa, beta, beta-S) AM-tbmadc

Problemi nello screening delle talassemie Microcitosi con HbA2 normale HbF elevate HbA2 “borderline” AM-tbmadc

HbA2, senza b-talassemia Limiti nell’utilizzo della sola HbA2 nella identificazione del portatore di b-talassemia HbA2, senza b-talassemia - condizioni acquisite (ipertiroidismo, anemia megaloblastica, terapia con farmaci anti-retrovirus) HbA2, in presenza di b-talassemia - alleli b talassemici “silenti” - interazione tra d e b talassemia - a. sideropenica grave - associazione tra b-tal. ed una variante con mutazione sulle catene a AM-tbmadc

Hemoglobin and HbA2 in non-b and b-thalassemia trait with iron deficiency b-thal trait In carenza di Fe si diminuisce la sintesi di catene alfa (per attivazione di un fattore trascrizionale HSP) mentre resta uguale la sintesi delle beta e delle delta. Competizione beta e delta per alfa: beta più affini, HbA2 cala non b Galanello et al., 1981 AM-tbmadc

Livelli di HbA2 in diversi tipi di mutazioni b-talassemiche severe 0 1 2 3 4 5 6 7 mild silent HbA2 (%) - Beta IVS1 –6 e’ la mutazione portoghese, molto diffusa nel mediterraneo - quando HbA2 e’ normale in assenza di MCV ed MCH basso e sintesi normale potrebbero essere i soggetti normali (3DS a destra della media) (R. Galanello, 2002) non b - 101 CT IVS2- 844 CG IVS1-6 TC b° 39 CT AM-tbmadc

Interazione d e b talassemia MCV, fl 77 MCH, pg 25 HbA2, % 1.6 65 20 4.9 MCV, fl 67 MCH, pg 21 HbA2, % 3.3 a/b ratio 1.92 d+ cd 27 G  T b° cd 6(-A) AM-tbmadc Family F.F.

HbF elevate db delezione HPFH - Hb F 9 – 20 %, sintesi catene a/b 1,6 – 2,4 HPFH HbF 3-4 % (scarso significato) HbF 16-20 % sintesi catene normale HPFH con HbF 3-4 % tipo “svizzero” Quasi sempre pancellulare (un poco di HbF si vede in tutte le cellule con i monoclonali) AM-tbmadc

Cause di aumento dell’HbF Genetiche Acquisite b-talassemia db-talassemia HPFH anemia congenita ipoplastica Espansione eritropoietica trapianto di midollo emolisi acuta gravidanza Associata con tumori ematopoietici leucemia juvenile cronica mielogena altri disordini mieloproliferativi sindromi preleucemiche Farmacologica 5-Aza HU Epo Butirrati Altri grassi a catena corta AM-tbmadc

Analisi con DHPLC di soggetti eterozigoti per mutazioni del gene beta e delta WT b 39 b IVSI nt 6 b 6 b IVSI nt 1 b IVSI nt 110 b IVSII 844 b IVSII nt 1 b -101 b -92 b -87  +27 AM-tbmadc

Terapia molecolare Terapia genica farmacologica (gene g) idrossiurea acido butirrico Trapianto genico (terapia genica somatica) trasfezione gene b-globinico normale vettore retrovirale murine leukemia Lentivirus Manipolazione dello “switch” Idrossiurea demetilazione sequenze regolatrici gene gamma Butirrato: neonati da diabetiche ritardo switch beta-gamma – inibizione istone deacetilasi (istoni acetilati permettono trascrizione) Trasfezione: si inserisce a caso Vettore con loci LCR da migliore espressione – effetto non durevole Lentivirus: minime sequenze HIV, 5’ 3’ LTR, splice donor e acceptor, packaging region, rev-region, gene beta globinico, 3’ enhancer, HS2-HS3-HS4 (LCR) cruciali: OK (cellule staminali murine) Lentivirus possono trasfettare CD34 Sperimentazione Lentivirus dal 2000. Ora (2006) aspetti di sicurezza (prevenzione della formazione di genomi virali autoreplicanti, e minimizzazione del rischio di oncogenesi da inserzione), ed ottimizzazione della produzione dei vettori virali AM-tbmadc

Antiossidanti: vit E, flavonoidi, polifenoli Danno ossidativo HbO2  MetHb Globine a o b  Emicromi  corpi di inclusione  legame alle membrane  degradazione eme  ROS  perossidazione lipida + GSH¯ + MDA + esposizione PS  emolisi Antiossidanti: vit E, flavonoidi, polifenoli Flavonoidi: curcemino Polifenoli: estratto di papaya La somministrazione di antiossidanti fa innalzare il glutatione ridotto, e riduce la produzione di ROS ma non basta per correggere l’anemia. Forse bisogna abbinare un chelante che blocchi il ferro libero intracellulare AM-tbmadc

Pathways coinvolte nel danno alle membrane degli eritrociti in α e β talassemia AM-tbmadc Weatherall DJ, 1998

Prodotti di degradazione delle catene globiniche: Globina Eme Emina (forma ossidata dell’eme) Fe libero FORMAZIONE DI ROS (reactive oxygen species) AM-tbmadc

ROS (reactive oxygen species) Gutteridge JMC, 1995 Danni a organelli intracellulari, proteine (banda 4.1) e lipidi di membrana AM-tbmadc

Meccanismi di perossidazione lipidica AM-tbmadc Gutteridge JMC, 1995

Meral A et al. 2000 In pazienti affetti da talassemia si riscontra un aumento significativo di TBARS e CD, markers di perossidazione lipidica… AM-tbmadc

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CLASSIFICAZIONE FUNZIONALE DELLE EMOGLOBINOPATIE (1/2) ------------------------------------------------------------------------------------------------- Anormalità Luogo Sintomatol. Esempio funzionale sostituzione 1) Nessuna Sup. esterna Nessuna Hb G Philadelphia a68 Asn ->Lys 2) Aggregazione Sup. esterna Anemia emol. Hb S ridotta solub. (omozigote) b6 Glu ->Val 3) Instabilità Eme/ Anemia emol. Hb Bristol ridotta solub. contatti subun. b67 Val ->Asp 4) Met Hb His prox./dis. Cianosi Hb M Hyde Park b92 His -> Tyr AM-tbmadc

CLASSIFICAZIONE FUNZIONALE DELLE EMOGLOBINOPATIE (2/2) ------------------------------------------------------------------------------------------------- Anormalità Luogo Sintomatol. Esempio funzionale sostituzione 5) Aumentata Contatto a1b2 Eritrocitosi Hb Chesapeake affinità O2 C-terminale b a92 Arg -> Leu 6) Diminuita Eme/a1b2 Cianosi Hb Kansas affinità O2 b102 Asn ->Thr 7) Ridotta produz. Mutazione Fenotipo Hb Constant catene a C-terminale a talassemico Spring (a+31) 8) Ridotta prod. Ibrido di fusione Fenotipo Hb Lepore catene b b talassemico AM-tbmadc

Drepanocitosi (anemia falciforme) AM-tbmadc

Fenotipo anemia falciforme (anemia emolitica cronica + crisi vaso-occlusive) Periostite metacarpale piede-mano Osteonecrosi della testa del femore Infarto cerebrale Sindrome acuta-toracica Retinopatie Epatopatie Ipostenuria da lesione midollare renale Ulcere malleolari Sequestrazione splenica Infezioni gravi da germi capsulati (pneumococco) AM-tbmadc

Correlazione genotipo-fenotipo nell’anemia falciforme Genotipo al locus b HbS/HbC HbS/b-talassemia Geni modificatori HbF (cromosoma X e 6) Aplotipi b-globinici Benin, Senegal, Bantù, Centro-Africa, Arabo-Indiano Polimorfismo C->T in -158 gG (HbF più elevata) a-talassemia Co-trasmissione con alfa talassemia non riduce le crisi dolorose, ma allunga la sopravvivenza AM-tbmadc