Laboratorio Clinica Pediatrica METHODS AND PITFALLS IN THE MEASUREMENT OF ANTI-ACTIN ANTIBODIES IN COELIAC DISEASE Fabbro Elisa, dottoranda primo anno Laboratorio Clinica Pediatrica

Anticorpi Anti Actina: nuovi marker sierologici nella celiachia In letteratura sono stati riscontrati differenti valori di sensibilità (82-25%) nella ricerca degli Anti-Actina (A.A.A.); mentre la specifcità ha ottenuto valori prossimi al 100%. (Am. J .Gastroenterol .2004;99:1551. Clin.Exp .Immunol 2004;137: 386). La valutazione retrospettiva degli A.A.A. in sieri conservati a -20°C ha prodotto valori di sensibilità pari al 43 %. Gli A.A.A. hanno mostrato una significativa correlazione con la lesione istologica della mucosa intestinale.

Obbiettivi: Allestire una metodica di “immunofluorescenza indiretta” per dosare gli A.A.A. al fine di misurare la loro sensibilità e specificità, indipendentemente dalla durata di conservazione dei campioni. Misurare la riproducibilità di questo test di “immunofluorescenza indiretto” mediante confronto dei risultati tra più operatori. Verificare il ruolo di fattori sierici (Actin Binding Protein) leganti l’ Actina, nell’inibizione del legame tra la proteina e il suo anticorpo. Realizzare un test immuno-enzimatico su fase solida (ELISA) basato sull’ antigene actina polimero

La famiglia delle “Actin Binding Proteins” (ABP) è molto eterogenea e comprende proteine in grado di legare e di modificare la struttura molecolare dell’Actina. Gelsolina Cofilina E’ possibile che tali molecole sieriche sequestrino l’Actina al legame con anticorpi specifci, inducendo risultati falsamente negativi•

Materiali e metodi Celiaci diagnosticati tra il 2000 e il 2004 : 102 (12 con lesione istologica 3a, 40 con lesione di tipo3b ,48 con lesione 3c); età media : 20 aa; sesso: 57 femmine, 45 maschi; Controlli : 103 donatori di sangue e 76 soggetti malati. Allestimento di vetrini attivati con cellule “Hep2” Trattamento fisico-chimico dei sieri per migliorare la sensibilità diagnostica del test degli A.A.A. Lettura al microscopio a fluorescenza

1) Risultato: Positività degli A.A.A. nei gruppi di studio e nei tre differenti metodi di trattamento dei campioni. Pz celiaci: № =102 Controlli sani: № =103 malati: № =76 % Positivi Sieri non trattati 48 % (№ :49) 14,6 % (№:15) 18,4 % (№:14) Sieri Riscaldati 82,4 % (№:84) 24,3 % (№:25) 48,7 % (№:37) Sieri con E.D.T.A. 76,5 % (№:78) 13,5 % 29 % (№:22)

IgA anti-actina su cellule “Hep2.” 1 2 3 IgA anti-actina su cellule “Hep2.” Le tre foto (x40) illustrano la reattività di un siero di celiaco (lesione istologica 3b): 1 siero non trattato; 2 siero eriscaldato; 3 siero in EDTA. La positività del test è evidente nei fotogrammi 2-3, mentre risulta essere poco visibile (freccia) nella foto 1. Il pretrattamento del siero con il riscaldamento o con l’EDTA facilita notevolmente l’osservazione al microscopio e rende il test più sensibile.

2) Risultato correlazione tra positività degli A.A.A. (sieri riscaldati) e grado di lesione istologica. Lesione № campioni Positivi % POSITIVI 12 8 66,7% 40 31 77,5% 48 44 91,7%

Riproducibilità degli A.A.A.: i risultati di tre operatori sensibilità NT R E 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 specificità trattamento

Riproducibilità degli A. A. A Riproducibilità degli A.A.A.: confronto della lettura tra più operatori Metodica del trattamento Kappa Forza di agreement Landis-Koch Riproducibilità Fleiss Non trattato 0,59 Moderata Buona Riscaldato O,61 Sostanziale E.D.T.A. 0,64 Kappa Forza della concordanza < 0,00 Povera 0,00 – 0,020 Lieve 0,21- 0,40 Discreta O,41-0,60 Moderata 0,61-0,80 Sostanziale 0,81-1 Quasi perfetta Tab. 1: griglia di valutazione di Landis-Koch Kappa Riproducibilità >0,75 Eccellente 0,40-0,74 Buona 0,00-0,039 Marginale Tab. 2: griglia di valutazione di Fleiss

Attività inibitoria degli ABP Molecole sieriche che mascherano il legame degli A.A.A. alla proteina

Attività inibitoria di fattori sierici (ABP Attività inibitoria di fattori sierici (ABP ?) presenti nel siero di soggetti A.A.A. negativi: Sequenza del test d’inibizione: 1. Preincubazione delle cellule con pool di sieri A.A.A. negativi. 2. Incubazione con siero di celiaco positivo agli A.A.A. L’attività inibitoria del pool A.A.A. negativo viene abolita dalla preincubazione con dosi crescenti di actina monomerica (5-10-15-20 μg/ml)

Verificare il ruolo degli (ABP) nell’inibizione del legame tra la proteina e il suo anticorpo. Prove di localizzazione 1):incubazione delle cellule con il solo pool di sieri sani A.A.A. negativi Prove di localizzazione 2): preincubazione di un pool di sieri A.A.A. negativi + 2 anticorpo: anti ADF e anti Gelsolina

Il nostro studio conferma che: Conclusioni: Il nostro studio conferma che: Il trattamento chimico e fisico migliora la sensibilità del test, anche in sieri conservati a -20°C per 2-4 anni, a scapito di una ridotta specificità (80%). Come tutti i test operatore-dipendente anche il presente test è caratterizzato da una bassa riproducibilità. Per questo motivo andrebbe organizzata una rete di laboratori per la standardizzazione e i controlli di qualità della ricerca degli A.A.A. Esiste una stretta correlazione tra gli A.A.A. e la lesione intestinale. Alcuni fattori sierici appartenenti alla famiglia delle ABP possono interferire con il legame tra l’ actina e suo anticorpo specifico.

Cardiomiopatie (CMPD) e A.A.A.: una nuova associazione La cardiomiopatia dilatativa è caratterizzata da una dilatazione del ventricolo sx dovuta ad una minor resistenza del miocardio nel quale alcune cellule muscolari sono sostituite da tessuto fibroso, con conseguente aumento della cavità cardiaca ma con minor capacità del cuore di pompare sangue. Probabilmente nelle CMPD idiopatiche esistono alcuni meccanismi di autoimmunità diretti contro proteine del citoscheletro (actina ?)

Cardiomiopatie e A.A.A.: una nuova associazione Positività degli A.A.A. in un gruppo di pazienti con CMPD e in parenti di primo grado: Sieri Riscaldati Probandi: № =63 Parenti: №=84 % Positivi 59,7 % (№:36) 21,4 % (№:18) A.A.A. : Fattore patogenetico (?)

CMPD,Famiglia & Autoimmunità II III II Leggenda: rosso = A.A.A. + bianco = A.A.A.- marrone = probando

Obbiettivi futuri: Continuare il lavoro di screening per la ricerca degli A.A.A. in pazienti con CMPD