Multicolor labeling - CGH Lezione 2 By NA

MULTICOLOR LABELING By NA

Aberrazioni numeriche Aberrazioni strutturali traslocazioni, inserzioni By NA

Sistema combinatoriale: MULTICOLOR FISH Il primo esperimento di FISH multicolore è stato descritto nel 1992 da Ried e coll. con l’impiego delle sette combinazioni ottenibili miscelando tre differenti fluorocromi, FITC, TRITC e IR680, per marcare fino a sette sonde genomiche. Sistema combinatoriale: n=3 fluorocromi 2n-1=7 combinazioni By NA

MARCATURA COMBINATORIALE RAPPORTO DI MARCATURA (percentuali diverse di fluorocromi) By NA

MULTICOLOR PROBES M- FISH: multiplex FISH, 5 fluorocromi (Speicher et al 1996); SKY: Spectral karyotyping FISH, 7 fluorocromi (Schrock et al 1996); COBRA FISH: combinatorial binary ratio labelling, 4 fluorocromi (Tanke et al 1999); Rx-FISH: rainbow cross species colour banding, cariotipo a bande colorate (Muller et al 1997); MCB: multicolor banding con 24 cocktail di painting parziali per pseudobandeggio (Chudoba et al 1999); cenM-FISH: multicolor FISH con 23 sonde centromeriche (Nietzel et al 2001); M-TEL: multicolor FISH con 41 sonde telomeriche (Brown et al 2000). By NA

M-FISH, SKY & COBRA (Multiplex-FISH, Spectral KarYotyping & COmbined Binary RAtio labelling) : finalità analisi simultanea di tutto il corredo cromosomico con un approccio rapido (come le bandeggiature Q, G e R): un singolo esperimento per lo studio dell’intero cariotipo; sistema affidabile di caratterizzazione simultanea di tutti i riarrangiamenti cromosomici; strumento di screening per l’identificazione di nuovi riarrangiamenti tumore-specifici e nuove regioni bersaglio. By NA

M-FISH, SKY & COBRA: applicazioni Identificazione di cromosomi marker, ring, hsr e double minutes; Corretta identificazione di traslocazioni quando il pattern di bandeggiatura non è ottimale, o in metafasi di scarsa qualità; Caratterizzazione di traslocazioni complesse. Identificazione di inserzioni cromosomiche. Individuazione di riarrangiamenti ‘criptici’. By NA

M-FISH, SKY & COBRA: limiti - Necessita’ di cellule in metafase con cromosomi non sovrapposti perche’ possano essere rivelati riarrangiamenti(piccole duplicazioni/delezioni, traslocazioni criptiche) che coinvolgono regioni di dimensioni >3Mb - Non e’ possibile evidenziare inversioni paracentriche ed alcune pericentriche - E’ difficile valutare la presenza di riarrangiamenti a carico dei telomeri By NA

Sistema combinatoriale: A = Rodamina B = Texas Red C = Cy 5 D = FITC E = Cy 5.5 Esempio Si ottiene così una specifica fluorescenza, o spettro, per ciascun cromosoma Sistema combinatoriale: n=5 fluorocromi 2n-1=31 combinazioni By NA

M-FISH methodology By NA

Si ottiene infine l’immagine totale combinando le informazioni delle acquisizioni effettuate con i sei filtri. By NA

By NA

Cariotipo con M-FISH Cariotipo complesso By NA

Cariotipo con SKY By NA

SKY Marker cromosomico By NA

SKY Traslocazione complessa By NA

COBRA-FISH RATIO IMAGE FIRST BINARY IMAGE By NA

conclusioni Vantaggi Limiti riarrangiamenti intracromosomici marcatori con neocentromeri o privi di centromero risoluzione: 3Mb riarrangiamenti tra più cromosomi identificazione piccoli marcatori (<17p) Limiti risoluzione: riarrangiamenti submicroscopici telomerici riarrangiamenti tra più cromosomi due esperimenti sequenziali singolo esperimento Vantaggi M-TEL-FISH cen-M-FISH M-FISH/SKY/COBRA By NA

Position on Chromosome Conventional CGH Test Genomic DNA Reference Genomic DNA Normal Tumour Cot-1 DNA Ratio Position on Chromosome gain deletion By NA 20

0.8 1 1.2 RAPPORTO DI FLUORESCENZA VERDE/ROSSO Software per l’analisi delle immagini digitali By NA

By NA

Small cell lung carcinoma By NA

Array CGH By NA

Northern Blot Espressione genica Sequenza ibridatata su mRNA By NA 25 G3PDH Sequenza ibridatata su mRNA Espressione genica By NA 25

Northern Blot 30,000 Geni 30,000 Northerns By NA 26

Evoluzione: Cambiamento prospettico che ribalta la visione statica Evoluzione: Cambiamento prospettico che ribalta la visione statica. Introduce in tempo come variabile RIVOLUZIONE By NA 27

Evoluzione: Cambiamento prospettico che ribalta la visione statica Evoluzione: Cambiamento prospettico che ribalta la visione statica. Introduce in tempo come variabile RIVOLUZIONE By NA 28

Evoluzione: Cambiamento prospettico che ribalta la visione statica Evoluzione: Cambiamento prospettico che ribalta la visione statica. Introduce in tempo come variabile RIVOLUZIONE By NA 29

Position on Chromosome CGH su microarrays Test Genomic DNA (Tumour DNA) Reference Genomic DNA Cot-1 DNA gain deletion Ratio Position on Chromosome Ratio Position on Sequence By NA 30

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Chip fabrication Conditioni controllate, chips identici si possono comparare facilemente e con precisione. By NA 33

SNP array SNP 1 2 3 4 5 6 7 AA * * AB * * * BB * * Chromosome By NA 34

SNP array genoma maschile normale By NA 35

SNP array genoma esempio patologico? By NA 36

SNP array 3 delezioni? By NA 37

Condivisione genoma genitore - figlio 1/2 fratelli 1/2 zio - nipote 1/4 cugini primi 1/8 cugini secondi 1/16 By NA 38

Ricombinazione mitotica(MR) Descritta in Drosophila da Curt Stern (1936) By NA 39

Ricombinazione mitotica(MR) By NA 40

Ricombinazione mitotica(MR) By NA 41

Ricombinazione mitotica(MR) By NA 42

Ricombinazione mitotica(MR) origina una popolazione a mosaico By NA 43

SNP array nei tumori UPD segnalata in alcuni tumori: Breast Cancer Retinoblastoma Ulveal melanoma Wilms tumour Myeloproliferative disorders (9p) Haematopoietic malignancies By NA 44

SNP array AML By NA 45

SNP array AML By NA 46

UPD + + By NA