Dottorato in Biochimica e Patologia dell’Azione dei Farmaci Dipartimento di Scienze Farmaceutiche e Biomediche IX ciclo Studio del ruolo funzionale e caratterizzazione strutturale del cuprocomplesso TFF1-Cu Il mio progetto di dottorato mira allo studio del ruolo funzionale e caratterizzazione strutturale del cuprocomplesso TFF1.Cu Tutor: Prof. Liberato Marzullo Dottorando: Sandro Montefusco 26/01/2012

Famiglia dei Trefoil Factors Introduzione: Famiglia dei Trefoil Factors Costituita da: peptide gastrico pS2/TFF1, peptide spasmolitico SP/TFF2 e fattore intestinale ITF/TFF3 Struttura - Motivo caratterizzato da tre anse e stabilizzato da tre ponti disolfuro Funzione Ruolo essenziale nei processi di restituzione e rigenerazione epiteliale nel tratto GI Coinvolgimento in cruciali processi fisio-patologici: insorgenza e sviluppo neoplastico, proliferazione, differenziamento, migrazione cellulare, apoptosi TFF1 appartiene alla famiglia dei fattori trifohglio che comprende il fattore spasmolitico TFF2 e il fattore intestinale TFF3. Sono caratterizati da una particolare struttura a trifolgio da cui prendono anche il nome. Sono espressi principalmente negli epitali dove svolgono funznione di riparo, differenziamento, migrazione cellulare e proliferazione

Hypothalamus – Hypophysis Introduzione: Siti di espressione: TFF1: stomaco, duodeno, colon, pancreas, ghiandole di Brunner, vescica, ghiandole salivari e lacrimali, epitelio respiratorio, ghiandole mammarie, dotti biliari. TFF2: stomaco, ghiandole di Brunner, epitelio del dotto pancreatico e biliare. TFF3: epitelio intestinale, cellule goblet, ghiandole Brunner, utero, mammella, ipotalamo, ipofisi. Lacrimal Glands Hypothalamus – Hypophysis I principali siti di espressioni sono gli epiteli gastrici ma si riscontrano livelli di espressione anche in altri distretti anatomici come i dotti pancreatici, ghiandole salivari e lacrimali, ipotalamo, ipofisi etc. Di particolare importanza è la secrezione di TFF1 e di TFF3 ad opera delle cellule goblet che sono particolari cellule delle pliche intestinali coinvolte nella produzione di muco. Bladder

Introduzione: Infiammazione Ulcere intestinali, soggetti affetti dal morbo di Crohn e infezioni da H. pylori presentano, nelle aree compromesse, elevati livelli di TFF1 Variazioni dei livelli dei peptidi TFF sembrano essere coinvolte nei processi neoplastici Tumor-suppressor TFF1 ridotto in metaplasie intestinali e adenomi gastrici, TFF1 completamente assente nel 40-60% di carcinomi gastrici Topi tff1 knockout sviluppano adenoma gastrico e carcinoma intramucosale Variazione dei livelli di espressione di TFF1 sono stati riscontranti in vari processi patologici. Dalle infezioni di Helicobacter pylori ai processi tumorigenici. In particolare il modello KO per TFF1 sviluppa adenoma gastrico intorno al 4° mese di vita. Ad oggi TFF1 viene utilizzato com marker del tumore al seno sensibile al trattamento ormonale. Carcinoma della mammella TFF1 indotto da estrogeni TFF1 marker tumorale

Trefoil Factor 1 L’analisi effettuata su intestino di ratti, resi nutrizionalmente carenti di rame, ha mostrato aumento dell’espressione del peptide TFF1. Real Time tff1 TFF1 lega specificamente il rame. L’interazione induce un cambio di conformazione nella struttura terziaria della proteina. Il nostro interesse per TFF1 nasce in seguito studi effettuati su intestino di ratti resi nutrizionalmente carenti del metallo. Questi studi mostrano TFF1 come uno dei principali geni upregolati in condizione di depletameno del rame. Successivamente si dimostra che proprio TFF1 ha un interazione specifica con il metallo e che questa interazione induce un cambio nella struttura terziaria della proteina.

Obiettivi: - Valutare l’espressione di TFF1 in condizioni di depletamento di rame. Studiare l’influenza del rame sull’attività biologica della proteina. - Analizzare il ruolo di TFF1 nei meccanismi di omeostasi del rame. - Studiare il ruolo del cuprocomplesso TFF1-Cu nelle infezioni da Helicobacter pylori.

L’espressione di TFF1 aumenta in condizioni di depletamento di rame Espressione di TFF1 in cellule AGS Real Time PCR Abbiamo così approfondito lo studio dell’espressione di TFF1 utilizzando cellule di carcinoma mammario MCF7. Queste cellule sono note esprimere TFF1 in presenza di estrogeni. Abbiamo così valutato l’espressione di TFF in condizione di depletamento del metallo utilizzando il chelante Batocuproina a due diverse concentrazioni per 24 e 48h. I grafici mostrano appunto un significativo aumento dell’espressione di TFF1 in presenza di trattamenti con il chelante. Come controllo positivo è stato utilizzato l’estradiolo. ** p value = 0,08 * p value < 0,05 L’espressione di TFF1 aumenta in condizioni di depletamento di rame

Analisi del promotore: Saggi di Luciferasi Abbiamo iniziato quindi uno studio sul promotore di TFF1 per individuare possibili elementi sensibili alle variazioni di concentrzione del metallo. Abbiamo amplifato medinte PCR frammenti di 1 e 2kb del promotore di tff1 e in seguito realizzato costrutti di delezione sul promotore di TFF1 con a monte il gene della luciferasi.

Analisi del promotore: Saggi di Luciferasi controllo -435 BCS anova p<0,05 I nostri dati fanno ipotizzare che possano esistere elementi sensibili al depletamento di rame in una regione tra -583 e -435 bp dall’ATG. Nella regione -583/-435 esistono elementi sensibili alle variazioni di concentrazione del metallo che regolano positivamente l’espressione del gene in condizioni di deprivazione di rame

Analisi del promotore L’analisi di sequenza con il softwar disponibile on line transfct ha mostrato la presenza di un sito putativo Sp1 tra le sequenze consensu con score più elevato. In letteratura sono noti dei siti Sp1 essere coinvolti nell’omeostasti del rame e così abbiamo voluto approfondire questa ipotesi. Abbiamo disegnato degli oligo nucleoetidi sulla regione putativa di legame. Due oligo: il primo con la sequenza wilde tipe e un secondo con la sequenza mutata proprio nel sito di legame. L’analisi della sequenza -583/-435 con il software Transfac ha mostrato la presenza di un sito putativo Sp1 tra le sequenze consensus con score più elevato

Analisi del promotore sonda: p Sp1 sonda: c Sp1 p Sp1: sequenza putativa di legame ad Sp1 del promotore di tff1 m Sp1: sequenza mutata nella regione putativa di legame c Sp1: sequenza di legame canonica ad Sp1 Scr: sequenza scrambled sonda: c Sp1 Mediante metodica band shift abbiamo dimostrato che esiste una reale e specifica interazione tra la sonda wt e proteine nucleari. Nella figura A vediamo appunto che la sonda mutata e una sonda controllo non inibiscono tale legame. Viceversa quando le proteine nucleari vengono incubate con la sonda fredda wt si osserva una diminuzione di segnale tra le proteine nucleari e la sonda marcata. Per verificare ulteriormente che questa interazione fosse spefica per la sequenza putativa di legame ad Sp1 abbiamo disegnato degli oligo noti legare il fattore di trascrizione Sp1. Abbiamo così marcato la sonda canonica per SP1 e utilizzato la nostra sonda wt per i saggi di competizione. Nella figura B si vede chiaramente che incubando sia con la sonda canonica fredda, sia con la sonda wt si osserva una diminuzione di legame tra proteine nucleari e la sonda canonica marcata. In figura C abbiamo ripetuto l’esperimento marcando però la sonda wt.

Analisi del promotore sonda: p Sp1 p Sp1: sequenza putativa di legame ad Sp1 del promotore di tff1 m Sp1: sequenza mutata nella regione putativa di legame c Sp1: sequenza di legame canonica ad Sp1 Scr: sequenza scrambled sonda: c Sp1 Mediante metodica band shift abbiamo dimostrato che esiste una reale e specifica interazione tra la sonda wt e proteine nucleari. Nella figura A vediamo appunto che la sonda mutata e una sonda controllo non inibiscono tale legame. Viceversa quando le proteine nucleari vengono incubate con la sonda fredda wt si osserva una diminuzione di segnale tra le proteine nucleari e la sonda marcata. Per verificare ulteriormente che questa interazione fosse spefica per la sequenza putativa di legame ad Sp1 abbiamo disegnato degli oligo noti legare il fattore di trascrizione Sp1. Abbiamo così marcato la sonda canonica per SP1 e utilizzato la nostra sonda wt per i saggi di competizione. Nella figura B si vede chiaramente che incubando sia con la sonda canonica fredda, sia con la sonda wt si osserva una diminuzione di legame tra proteine nucleari e la sonda canonica marcata. In figura C abbiamo ripetuto l’esperimento marcando però la sonda wt. Le proteine degli estratti nucleari legano in modo specifico la sequenza putativa di legame ad Sp1

Obiettivi: - Valutare l’espressione di TFF1 in condizioni di depletamento di rame. Studiare l’influenza del rame sull’attività biologica della proteina. - Analizzare il ruolo di TFF1 nei meccanismi di omeostasi del rame. - Studiare il ruolo del cuprocomplesso TFF1-Cu nelle infezioni da Helicobacter pylori.

Rame e forma omodimerica di TFF1 condizioni riducenti condizioni non riducenti Western Blot: surnatanti di cellule AGS-AC1 TFF1 dimero Come detto prima TFF1 puà esistere nella forma monomerica, dimerica e omodimerica. Possiede una settima cisteina libera che consentegli permette di esistere nella forma monomerica dimerica e omodimerica. Esperimenti in vitro e su colture cellulare, ha permesso di dimostrare che il rame promuove la formazione dell’omodimero. Le immagini sono dei western blot effettuati in condizioni riducerenti e non riducenti sui surnatanti di cellule AGS-AC1 in cui è stata indotta l’espressione di TFF1 con dox e sono stati incubati in mezzo con eccesso di rame. Il risultato significativo è che comunque è noto dalla letteratura che la forma dimerica è quella biologicamente più attiva Il rame promuove la formazione dell’omodimero

Migrazione Cellulare: Wound Healing AGS-AC1

Migrazione Cellulare: Wound Healing BCS + dox - dox * p-value < 0,05 distance (m) * Migrazione Cellulare: Wound Healing 24 h distanza (µm) AGS-AC1 TFF1 Abbiamo quindi voluto testare se il rame influenzasse una attività biologica già descritta per TFF1. Attraverso saggi di wound healing utilizzando un particolare clone di cellule gastriche iperesprimente TFF1 in modo inducibile, abbiamo appunto dimostrato che l’induzione della proteina determinana un aumento della migrazione cellulare e che la chelazione di rame modula negativamente l’attività motogenica di TFF1. (Tosco A, Monti MC, Fontanella B, Montefusco S, D'Andrea L, Ziaco B, Baldantoni D, Rio MC, Marzullo L., Cell Mol Life Sci. 2010) * p-value < 0,05 L’induzione di TFF1 determina un aumento della migrazione cellulare La chelazione di Cu modula negativamente l’attività motogenica di TFF1

Obiettivi: - Valutare l’espressione di TFF1 in condizioni di depletamento di rame. Studiare l’influenza del rame nella formazione dell’omodimero di TFF1 e sulla sua attività motogenica. - Analizzare il ruolo di TFF1 nei meccanismi di omeostasi del rame. - Studiare il ruolo del cuprocomplesso TFF1-Cu nelle infezioni da Helicobacter pylori.

Rame e secrezione di TFF1 in AGS-AC1 Controllo Cu 10 M Cu 100 M controllo Cu 10 μM Cu 100 μM r TFF1 72 h Sempre mediante western blot abbiamo poi valutato se il rame promuove variazioni nella secrezione della proteina. Mediante metodica western blot surnatanti di cellule iperesmprimenti TFF1 sono stati anlizzati in condizioni riducenti a 24 48 e 72 ore dall’induzione. Nei grafici sono riportati le analisi densitometriche mentre la figura in alto mostra l’andamento a 72 ore.risultata evidente che i campioni trattati con il rame hanno si ha un ridotta secrezione di tff1. Questi risultati fin qui ottenuti ci hanno spinto ad investigare un possibile ruolo della proteina nell’omeostasi del metallo. In cellule incubate in eccesso di rame, si osserva un ritardo nella secrezione della proteina

TFF1 e omeostasi del rame +/+ -/- Fegato Stomaco Intestino KO tff1 AGS-AC1 Come prima analisi abbiamo voluto determinare mediante metodica di assorbimneto atomico, la concentrazione di rame in fegato stomaco e intestino di topi ko out per TFF1. Nella nostra analisi non determiniamo differenze significative. Abbiamo così deciso di passare ad un modello più semplice in cui poter seguire e regolare sia l’espressione della proteina inducibile con dox sia la concentrazione del rame.

Cellule iper-esprimenti TFF1 accumulano quantità maggiori di rame TFF1 e omeostasi del rame Abbiamo seminato cellule AGS AC1, indotta l’espressione di tff1 e incubate in mezzo privo di siero. Al tempo 0 sono state trattate con rame 10 um e nei tempi successivi raccolte e misurata la concentrazione di rame all’interno della cellula. Nel grafico è evidente che cellule iperesprimenti TFF1 accumulano quantità maggiore di rame. Cellule iper-esprimenti TFF1 accumulano quantità maggiori di rame 24 h -S +/- dox 0 20 80 300 AGS-AC1 Cu 10 M

Cellule iper-esprimenti TFF1 trattengono il rame per tempi più lunghi TFF1 e omeostasi del rame Analogamente abbiamo incubato le cellule con 10 um di rame, e al tempo 0 abbiamo lavato con PBS, trattate con il chelante del rame e raccolte le cellule nei differenti tempi. Nel grafico è evidente che cellule iperesprimenti TFF1 (in nero) trattengono quantità maggiori di rame. L’iptesi è che quindi in particolari condizioni, TFF1 potrebbe essere coinvolto nell’omeostasi del metallo. 24 h -S Cu 10 M +/- dox Cellule iper-esprimenti TFF1 trattengono il rame per tempi più lunghi 0 20 80 120 300 600 AGS-AC1 BCS 500 M

TFF1 e omeostasi del rame Bassi livelli di rame INGRESSO chelando Alti livelli di rame TFF1 Cu2+ 22

Obiettivi: - Valutare l’espressione di TFF1 in condizioni di depletamento di rame. Studiare l’influenza del rame sull’attività biologica della proteina. - Analizzare il ruolo di TFF1 nei meccanismi di omeostasi del rame. - Studiare il ruolo del cuprocomplesso TFF1-Cu nelle infezioni da Helicobacter pylori.

Helicobacter pylori: interazione con TFF1 H. pylori interagisce con TFF1 Ipotesi per l’infezione tessuto- specifica caratteristica del batterio La porzione oligosaccaridica degli LPS di H. pylori legano TFF1 nella forma dimerica Il pH ottimale di questa interazione è tra 5.0 - 6.0 Nell’utlimo anno di dottorato infine abbiamo voluto approfondire alcune aspetti particolari. Alcuni recenti lavori hanno mostrato una specifica interazione tra la nostra proteina di interessa TFF1 e il patogeno gastrico Helicobacter pylori. Tale interazione avviene sulle porzioni ologosaccaridiche del batterio e in un range di pH ottimale intorno a 5-6. Ipotizzavamo quindi che TFF1 e la sua regolazione rame dipendente potesse avere un ruolo nell’itnerazine con il batterio. In particolare perché Hp lega specificamente la proteina nella forma dimerica che noi abbimao visto essere favorita dalla presenza di rame.

Helicobacter pylori: introduzione 1892 - Il medico italiano Giulio Bizzozero descrisse per la prima volta batteri spiraliformi nello stomaco di animali. 1893, Arch Mickrobiol Anat 1984 - Due ricercatori australiani, Marshall e Warren, descrissero per la prima volta una relazione tra strani bacilli ricurvi, dapprima classificati entro il genere Campylobacter, con forme di gastrite attiva e ulcere duodenali 1984, Lancet; 8390:1311-5 1989 - Classificazione del genere Helicobacter Goodwin et al 1989, int j syst bacteriol, 39:397 Oltre un secoo fa un medico italiano descrisse nello stomaco di animali un batterio spiraliforme. Soltanto nel 1984 due austrailaini descrivono il batterio classifcandolo nel genere campylobacter associandolo aad alcune patolgoia gastriche. Nel 89 invece si calssifica un nuove genere Helicobacter e nel 2005 i due austrailaini ricevono il nomebl per la medicina. 2005 - I due ricercatori australiani ricevono il Nobel per la medicina

Helicobacter pylori: introduzione Gram Negativo Dimensioni: 0,5-1 m x 2-4 m Microaerofilo: 37°C 3-5 giorni Mobile per la presenza di 4-6 flagelli Genoma: 1,4 - 1,7 Mb Patogeno per l’uomo Ureasi positivo Trasmissione: orale-orale / fecale-orale / gastro-orale Epidemiologia: endemica adulti bambini >50 anni 2-10 anni paesi industrializzati 35-40% 5-10% paesi in via di sviluppo 80-90% 45-50% Helicobacter Pylori è un batterio gram negativo, microaerofili, ureasi positivo. Riesce appunto a colonizzare ambienti ostici come l’ambiente gastrico proprio per alcune particolarità peculiari. Di particolare interesse sono la sua trasmissione e gli studi epidemiologici del batterio. Non sono ancora chiare quali sono le principali vie di trasmissione sicuramente orale-orale, fecale-orale e gastro orale. Inoltre studi epidemiologiic mostrano come in paesi in via di sviluppo la presenza di Helicobacter sia maggiore soprattutto nelle fascie di età più piccole. Questo è riconducibile alle condizioni igienico sanitarie non ottimali. Metà della popolazione adulta mondiale è positiva ad helicobacter pylori. È anche vero che però solo una piccola percentuale manifesta patologie riconducibili al batterio. Questo è dovuto certametne alla variabilità di ogni singolo individuo ma soprattutto alla grande variabilità che si ha all’interno dello stesso batterio.

Helicobacter pylori: fattori di virulenza Cag island: locus ~ 40 kb, 31 geni. Molti di questi geni codificano per il sistema di secrezione di tipo IV. CagA: proteina batterica che transloca nella cellula ospite promuovendo cambiamenti morfologici e alterazioni della membrana plasmatica. VacA: altera la permeabilità della membrana mitocondriale promuovendo l’apoptosi; stimola segnali pro-infiammatori; altera il normale traffico delle vescicole del compartimento endosomiale provocando la formazione di canale e formazioni di vacuoli. BabA2: lega l’antigene Lewis(b) delle cellule epiteliali gastriche. Cag Island Suerbaum S. & Josenhans C., Nature 2007 Cover T.L.. & Blanke S.R.., Nature 2005 Effects of VacA Sulla base di queste differenze si classificano ceppi più o meno associabili al rischio di malattie. I fattori di rischio principali sono: cag island e i geni Vac A e BabA2. L’isola Cag A è una regione di circa 40 kb contenente una trentina di geni. Molti di questi geni presentano omologia con i geni che codificano con il sistema IV di secrezione. Il gene terminale dell’isola è CagA, usato come marker per analisi genica. Dopo adesione la proteina CagA transloca nella cellula epiteliale dove viene fosforilata promuovendo dei cambiamenti morfologici nella cellula ospite.

Helicobacter pylori: LPS Bassa immunogenicità degli LPS di H. pylori Particolari variazioni nella componente “Lipide A” Infezioni a lungo termine Infiammazione cronica promuove un danno gastrico I lipopolasiccaridi sono componeni della parte cellulare esterna dei batteri G-. Sono molecole altamente complesse aventi tutte le caratteristiche dell’immunogenicità, tanto da essere definite il più potente immunogeno naturale. Hanno peso molecolare superiore a 10 kD, differiscono per struttura sia nei batteri delle stesso ceppo sia nei batteri di ceppi diversi. Distinguiamo le seguenti regioni: Lipide A, Core, Antigene Somatico O. Il lipide A è la frazione idrofobia che consente alla molecola di rimanere ancora alla paete batterica. Il lipide A è a sua volta legato a una frazione proteica, denominata endotossina, a cui è imputata la tossicità, Core o polisaccaride R: consiste di una corta catena di zuccheri. Ha funzione antigenica e varia strutturalmente da ceppo a ceppo. La regione O-poly-saccaride invece è costiutita da unità ripetute di zuccheri. Gli LPS di H. pylori presentano una bassa immunogenicità. In parte questo può essere spiegato dalla particolare struttura che gli LPS di H. Pylori hanno nella regione del Lipide A. Neli siero le proteine leganti gli LPS (LBP) agiscono come proteine catalitiche per presentare il complesso LPS-LBP ai macrofagi-monociti. Un alterata struttura proprio della porzione lipidica A rende tale processo meno efficiente. La porzione Lipidica degli LPS di Hp infatti è simile a quella di alcuni batteri che popolano in modo fisiologico il nostro intestino. Probabilmente la caratteristica di bassa immunologicità rende il batterio ancora più pericoloso. Si prolunga infatti la sua infezione rispetto a quella di un batterio più aggressivo ma con una vita più breve.

Helicobacter pylori: LPS Lisati Cellulari Frazioni Subcellulari LPS Nel 2008 dopo aver dimostrato una interazione e colocalizzazione di TFF1 nella mucosa gastrica con hpylori, è stato dimostrato che TFF1 lega il batterio attraverso una interazione su alcuni zuccheri dei lipopolisaccaridi. L’ipotesi che abbiamo voluto verificare in collaborazione con l’università di dublino è quella che TFF1 è coinvolto nell’infezione di H pylori e che il rame, probabilmente promuovendo la formazione dell’omodimero noto legare il batterio, può modulare l’infezione TFF1 mediata.

Effetti dei trattamenti sulla vitalità di H. pylori Helicobacter pylori: Influenza di TFF1 nella colonizzazione Cu 10 µM BCS 500 µM Dox Effetti dei trattamenti sulla vitalità di H. pylori Abbiamo utilizzato anche per questi esperimenti il clone cellulare AGS-AC1 esprimenti TFF1 in modo inducibilePoi abbiamo valutato se i nostri trattametni potessero essere tossici ai batteri ma fortunatamente non ci sono differenze nella vitalità dei batteri durante i trattamenti.

rosso - H. pylori verde - TFF1 blu - nuclei Helicobacter pylori: Infezione di H. pylori in AGS-AC1 AGS-AC1 rosso - H. pylori verde - TFF1 blu - nuclei Controllo + Dox Nelle immunofluorescenze vediamo in rosso l’infezione di Helicobacter pylori e in verde l’espressione di TFF1 nelle cellule trattate con doxiciclina. Il western blot invece mostriamo la fosforilazione della proteina batterica CagA. La fosforilazione di Cag avviene nella cellula infettata quindi è prova che la cellula è stata infettata dal batterio. CagA 130 kDa

Helicobacter pylori: Influenza di TFF1 nella colonizzazione Infezioni con ceppo H. pylori P12 wild-type Cu 10 M BCS 500 M Cu - + - + Dox - - + + BCS - + - + Dox - - + + Hp Abbiamo quindi valutato il grado di colonizzazione di Helicobacter pylori in cellule in cui veniva indotto TFF1 con la doxciclina e quando questa induzione era accompagnata da un amento della cocnetrazione di rame. I grafici mostrano che TFF1 aumenta il grado di colonizzazione da parte del batterio sulle cellule gastriche. Inoltre vediamo un aumento significativo in presenza di rame. Questi risultati confermano le ipotesi che TFF1 ha un ruolo di primo piano nelle infezioni di Helicobacter. Probabilmente questo tipo di interazione spiegherebbe anche la specifica azione tossica di helicobacter nei tessuti gastrici. T-test : p-value **< 0,01 * <0,05 TFF1 svolge un ruolo significativo nelle infezioni di H. pylori Il rame modula positivamente l’infezione di H. pylori mediata da TFF1

Helicobacter pylori: Influenza di TFF1 nella colonizzazione Wt P12 Il ceppo mutato P12HP∆1191 non interagisce con TFF1 P12HP479 P12HP1191 (Dolan B. et al., dati confidenziali, in stampa) Nel laboratio dove svolgo questi ultimi esperimenti sono stati effettuati diversi sutid per individuare le regioni specifiche coinvolte nel legame a TFF1. Sono stati costruiti dei mutanti negli LPS e si è visto che mutanti di differenti lunghezze negli LPS fosser critici per il legame a TFF1. Il mutante 479 infatti lega TFF1 e si comporta in modo analogo al wt. Viceversa 1191 colonizza in modo meno efficiente e non ha legame per TFF1. Abbiamo quindi utilizzato questi mutanti per gli stessi esperimenti di colonizzazione sul clone cellulare di cellule gastriche. HP479 codifica una D-glycero-D-manno-heptosyltrasferase HP1191 codifica una LD heptosyltransferase

Helicobacter pylori: Influenza di TFF1 nella colonizzazione Infezioni con ceppo mutato HP479 Cu 10 M BCS 500 M Cu - - + Dox - + + BCS - - + Anche in questi esperimenti il mutante 479 presenta un andamento sovrapponibile a quello wt mentre per il il mutante 1191 non si hanno variazioni T-test : p-value **< 0,01 * <0,05

Helicobacter pylori: Influenza di TFF1 nella colonizzazione Infezioni con ceppo mutato HP1191 control Dox Dox Cu Cu - - + Dox - + + Nel mutante 1191, incapace di legare la proteina, non si assiste ad alcuna differenza nei trattamenti.

Helicobacter pylori: interazione con TFF1 HT29 MTX E12 (E12): Subclone di cellule HT29, colon carcinoma umano, caratteristiche per la formazione di uno strato mucoso. (Alemka A., et al., Infect Immun. 2010) Un altro clone di cellule che stiamo utilizzando per questo tipo di studi è un particolare clone di cellule di colon carcinoma umano. Queste cellule hanno la caratteristica di formare uno strato mucoso. Dalle immagini appunto vediamo in rosa lo strato mucoso formato da un monostrato di cellule. Sarà possibile quindi caratterizzare la formazione di muco in questo clone cellulare e valutare d conseguenza il grado di colonizzazione di Helicobacter pylori. TFF1 e H. pylori colocalizzano nello strato mucoso (Dolan et al., dati confidenziali, in stampa)

Helicobacter pylori: interazione con TFF1 Infezioni in HT-29 E12 con ceppo H. pylori P12 wild-type Cu 10 M BCS 500 M Analogamente a quanto avviene nelle AGS-AC1 anche per il clone E12 abbiamo un aumento dei livelli di colonizzazione nelle cellule trattate con il rame. IN particolare, nelle cellule trattate con BCS, abbiamo una riduzione statisticamente significativa. T-test : p-value * <0,05

Rame e strato mucoso HT29 MTX E12 (E12): Subclone di cellule HT29, colon carcinoma umano, caratteristiche per la formazione di uno strato mucoso. (Alemka A., et al., Infect Immun. 2010) Come detto primo le cellule E12 sono state cresciute su piastre transweel al fine di favorire la polarizzazione e la secrezione di muco. Con una particolare metodica abbiamo incluso i filtri nel liquido di inclusione OCT e effettuato immunofluorescenze e colorazioni alcian blu neutral red al fine di studiare lo strato mucoso.

Rame e strato mucoso A B C D E F controllo In queste immagini mostriamo delle IF per TFF1 e la mucina MUC5ac nota essere coespressa insieme a TFF1 nel tessuto gastrico. È evidente che nei campioni trattati con il rame si assiste ad un segnale maggiore sia per il fattore peptidico sia per muc5ac.

Rame e strato mucoso controllo Cu Di evidenza maggiore sono le colorazioni con neutral red - alcina blu. Tale colorazione evidenzia le secrezioni mucose in blu e in rosso il monostrato di nuclei. È evidente che lo strato di muco è più spesso nei campioni trattati con il rame. Abbiamo così quantizzato su tre differenti sezioni lo strato di muco.

Risultati Il rame influenza l’espressione della proteina. Nel promotore di tff1 sono presenti elementi sensibili alle variazioni di concentrazione del metallo. Il rame favorisce l’omodimerizzazione di TFF1 e la sua attività motogenica. TFF1, nel modello cellulare AGS-AC1, è coinvolto nei processi di assorbimento/secrezione del metallo. TFF1 favorisce l’infezione di H. pylori. Il rame modula positivamente l’infezione di H. pylori mediata da TFF1.

Prospettive future Verificare l’effettivo legame di Sp1 sul promotore di TFF1. Approfondire il coinvolgimento di TFF1 nei meccanismi di omeostasi del rame. Individuare la regione di TFF1 coinvolta nel legame con i LPS di H. pylori.

Ringraziamenti Prof. Liberato Marzullo Prof. Alessandra Tosco Università di Salerno Dipartimento Scienze Farmaceutiche e Biomediche Dr. Marguerite Clyne University College Dublin School of Medicine & Medical Science Prof. Liberato Marzullo Prof. Alessandra Tosco Dr. Bianca Fontanella Dr. Roberta Esposito Dr. M.-C. Rio Institute of Genetics and Molecular and Cellular Biology - CNRS. Strasbourg, France Dr. D. Baldantoni Dipartimento di Chimica - Università di Salerno Coordinatrice del Dottorato Prof. Antonella Leone Considero valore sapere in una stanza dov’è il nord, qual è il nome del vento che sta asciugando il bucato. E. de Luca