TERAPIA GENICA Trasferimento di geni esogeni in cellule somatiche di un paziente per correggere un difetto genetico ereditato o acquisito o per introdurre nuove funzioni o proprietà.

TERAPIA GENICA Speculazioni sulla possibilità di effettuare una terapia genica sono degli anni ’60 Primo trial clinico approvato in USA nel 1989. Primo trial clinico in Italia per la correzione del deficit di adenosina deaminasi (14 settembre 1992) al 2001: 596 clinical trials di terapia genica (3464 pazienti) al 2007: circa 650 clinical trials di terapia genica (problemi inefficacia, tossicità)

Gene Therapy to be possible? What is required for Gene Therapy to be possible? 1) Understanding of the disease process 2) Structure/function of gene to be introduced 3) Animal model and assessment of function 4) Efficient delivery of gene 5) Control of gene expression 6) Prevention/control of immune responses 7) Clinical trial

TERAPIA GENICA-applicazioni Malattie ereditarie (es. distrofia muscolare, fibrosi cistica) per far esprimere la proteina mancante Malattie neoplastiche in cui i geni introdotti possono contribuire a distruggere le cellule neoplastiche Alterazioni del sistema immunitario per modificare la risposta immune Malattie infettive per potenziare i meccanismi di difesa

Gene Transfer: getting genes into cells Two main routes: In vivo: i.v. or i.m. injectable; or non-invasive (eg “sniffable”) Ex vivo: hepatocytes, skin fibroblasts haematopoietic cells

Gene delivery approaches Physical methods Non-viral vectors Viral vectors

Physical methods Injection of naked DNA Electroporation in vivo or ex vivo Ballistic technology – the “gene gun”

Effect of Electric Field on Cell Membrane

genetically engineered Ex vivo electroporation cells obtained from skin biopsy cells are reinjected gene introduced into cells by electroporation genetically engineered cells are propagated

Gene Gun

Metodi fisici Vantaggi Svantaggi Nessuna limitazione per numero e dimensione del gene Scarsamente efficiente se non per certi tipi cellulari Reazioni immunitarie per DNA batterico Solo per tessuti superficiali Scarsa penetrazione nelle cellule per l’elevata carica negativa ad eccezione di cellule muscolari scheletriche e miocardiche, alcuni tipi di tumori, cute, cellule epatiche, ghiandola tiroidea. Reazione immunitaria Esposizione chirurgica del tessuto

Metodi fisici Strategie per migliorare l’efficienza: associazione del DNA a polimeri cationici (pol. lineari, es. poli-lisine; pol.ramificati, es. polietilenimine o PEI; pol. sferoidali, es. poliamidoamine)

Vettori non virali -Liposomi Vescicole sferiche costituite da un doppio strato fosfolipidico idrofilico idrofobico

Liposome-mediated Gene Transfer complex DNA endocytosis nucleus membrane fusion

Liposomi Vantaggi Svantaggi Nessuna limitazione per numero e dimensione del gene Facili da produrre Scarsa tossicità (?) Efficienza modesta Espressione a breve termine Scarsa penetrazione nelle cellule per l’elevata carica negativa ad eccezione di cellule muscolari scheletriche e miocardiche, alcuni tipi di tumori, cute, cellule epatiche, ghiandola tiroidea. Reazione immunitaria Esposizione chirurgica del tessuto

TERAPIA GENICA Caratteristiche ideali di un vettore per terapia genica: produzione ad elevate concentrazioni con metodo facile e riproducibile; transgene regolato dai suoi elementi di regolazione; abilità di raggiungere specifici tipi cellulari; mancata stimolazione di risposta immunitaria da parte dell’ospite

TERAPIA GENICA Integrazione del transgene Vantaggi: perpetuo; può consentire un’espressione stabile ed una cura. Svantaggi: un’inserzione random può rendere silente il transgene o disregolare geni dell’ospite effetti a lungo termine (?)

TERAPIA GENICA Transgene episomale Vantaggi: assenza di mutagenesi inserzionale o effetti a lungo termine. Svantaggi (?): espressione transiente; necessità di trattamenti ripetuti

Vettori virali Quelli utilizzati per terapia genica sono modificati affinchè possano infettare cellule di mammifero, ma non siano in grado di replicarsi. Retrovirus Adenovirus Lentivirus Adeno-associated virus Herpes simplex virus

Engineering a Virus into a Vector Therapeutic gene Packaging Vector DNA Helper DNA essential viral genes wildtype virus replication proteins Viral vector Packaging cell structural proteins Based on Kay et al 2001

RETROVIRUS RNA virus di circa 10 kb con conversione di RNA a DNA mediante una trascrittasi inversa Vettori principalmente utilizzati sono derivati dal virus Moloney della leucemia murina. transgene si integra stabilmente in cellule in mitosi inattivato dal complemento

RETROVIRUS Potenziale tossicità: generazione di virus replicazione-competenti (per ricombinazione in fase di produzione o nell’ospite) mutagenesi inserzionale (tumori?)

LENTIVIRUS Vettori retrovirali descritti per la prima volta nel ’96 Basati sul virus HIV-1 Possono transdurre anche cellule non in divisione Potenziale tossicità: Simile a retrovirus con l’aggravante che si tratta di un patogeno per l’uomo (studio di lentivirus felini o equini)

ADENOVIRUS DNA virus di circa 36 kb causano infezioni benigne del tratto respiratorio; infettano cellule in divisione e non; facili da produrre in grande quantità; ospitano geni di grandi dimensioni; entrano nelle cellule mediante endocitosi; trasgene episomale;

ADENOVIRUS Effetti sfavorevoli: Espressione a breve termine Reazioni infiammatorie Risposta immune dell’ospite: cellulare (prod. di linfociti T contro le cellule infettate) umorale (prod. di anticorpi che preclude altri trattamenti) Tossicità acuta

ADENO-ASSOCIATED VIRUS DNA virus non patogeni che richiedono adenovirus o herpesvirus per replicare Infettano cellule in divisione e non Può ospitare transgeni non superiori a 4.5 kb Integrazione del transgene Inserzione sito-specifica nel cromosoma 19 (?)

FIBROSI CISTICA Malattia a carattere autosomico recessivo causata da mutazioni della proteina transmembrana CFTR coinvolta nel trasporto degli ioni Cloro nelle cellule epiteliali di vari organi. CFTR Alterazione di CFTR causa accumulo di muco denso e viscoso nei polmoni e alterazioni funzionali in fegato, pancreas, organi riproduttori Terapia sintomatica.

Risultati sperimentali: CFTR -terapia genica Necessità di intervenire in vivo Risultati sperimentali: Topo KO (patologia polmonare modesta) instillazione tracheale di liposoma-CFTR: promettente Tossicità vettori virali testata su diverse specie animali risultato variabile

CFTR -terapia genica Studi clinici (instillazioni tracheali o spray nasale): Liposoma -CFTR: bassa efficienza di trasfezione e di breve durata Adenovirus-CFTR: prima generazione problemi infiammatori e reazioni anticorpali; scarsa efficacia; seconda generazione meglio tollerati, scarsa e breve espressione AAV-CFTR: ben tollerato, ma espressione breve PEG-poliK-DNA: nessuna tossicità, effetto per 6 giorni Potenziali sviluppi futuri: cellule staminali eterologhe o modificate geneticamente

ADA deficiency Malattia a carattere autosomico recessivo causata da deficit o alterata funzionalità dell’enzima Adenosina deaminasi, coinvolto nel metabolismo delle purine. Conseguenze: accumulo di dATP, dADP, dAMP; blocco produzione linfociti T, NK, B; difetti scheletrici, disturbi comportamentali, alterazioni rene-fegato. Patologia letale per grave immunodeficienza.

Possibilità terapeutiche: ADA deficiency Possibilità terapeutiche: Trapianto di midollo Terapia sostitutiva: PEG-ADA bovino i.m. 1-2/sett.; problemi compliance, non-responders (15-20%) Terapia genica ex-vivo

Terapia genica - ADA deficiency In linfociti T periferici: risultati soddisfacenti ottenuti con sospensione di PEG-ADA vantaggi: fattibilità e sicurezza; linfociti T ingegnerizzati vivono a lungo; limiti: ripristino funzionalità confinata ai linfociti T; necessità di infusioni ripetute.

Terapia genica - ADA deficiency In cellule staminali del midollo osseo: Protocollo- Studio effettuato in due bambini di 6 mesi e 30 mesi Sospensione PEG-ADA. Cellule prelevate dal midollo osseo e infettate con vettore retrovirale Moderata mieloablazione con Busulfan (2mg/kg/die per 2 gg) due e tre giorni prima del reimpianto Risultati a 360 giorni: Ripristino linfociti B, T, NK e crollo livelli metaboliti purinici nel paziente più giovane. Buoni risultati solo a carico di linfociti T e NK nel secondo paziente.

SCID-X1 (severe combined immunodeficiency disease) Malattia ereditaria legata al cromosoma X Grave immunodeficienza caratterizzata dalla mancata maturazione dei linfociti T e NK Terapia genica ex-vivo con vettori retrovirali in cellule staminali ematopoietiche. Dopo tre anni, sviluppo di leucemia dei linfociti T in due bambini (mutagenesi inserzionale al locus LMO-2, cromosoma 11) Ad oggi 4 casi documentati

OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO

Struttura modificata per aumentare la resistenza alle nucleasi: oligonucleotidi fosforotioati (stabilità in vitro, buona emivita)

OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO Problematiche: Specificità Legame a fattori di crescita e loro recettori (es. PDGF, VEGF, EGFR) Tossicità pre-clinica : nei roditori immunostimolazione e degenerazione tubulare renale e epatica (alte dosi); nelle scimmie inibizione cascata della coagulazione, attivazione cascata del complemento

OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO: applicazioni Vitravene (Fomivirsen) - Novartis - Primo oligonucleotide antisenso approvato in terapia (FDA,1998). Distributo in USA, Europa, Brasile Indicazioni terapeutiche: trattamento locale di retinite da CMV in soggetti con AIDS Bersaglio: sequenza di mRNA della regione IE2 del CMV essenziale per infettività Tossicità: infiammmazione, aumento di pressione intraoculare, danni alla retina

APTAMERI

PEGAPTANIB - Macugen® (Eyetech Pharm./Pfizer) RNA aptamero diretto contro il vascular endotelial growth factor (VEGF)-165, isoforma responsabile di neovascolarizzazione oculare patologica e permeabilità vascolare; Indicazione terapeutica: degenerazione maculare associata all’età

struttura e sede di legame PEGAPTANIB struttura e sede di legame Modificazioni che aumentano la stabilità (O-met), affinità (F), emivita (PEG). dT =deossiTimidina Purine 2’-O-metilate Heparin-binding domain VEGF Pirimidine 2’-fluorurate

APTAMERI Selettività Scarsa tossicità (?) Disponibiltà di “antidoti” Alternativa all’uso di anticorpi (?) Potenziali applicazioni: infezioni, cancro, patologie cardiovascolari