COME RICONOSCERE UNA SEQUENZA REGOLATORIA DI CIRCA 10 NUCLEOTIDI FRA I 3000000000 CHE COMPONGONO IL GENOMA UMANO?

RICONOSCONO I PROMOTORI? LE RNA POLIMERASI COME RICONOSCONO I PROMOTORI? Transcribed region Promotore -contiene sequenze Specifiche per il legame della polimerasi

DEL PROMOTORE PROSSIMALE FATTORI DI TRASCRIZIONE • FATTORI DI TRASCRIZIONE GENERALI (BASALI) - RICONOSCONO ELEMENTI “core promoter” • REGOLATORI SPECIFICI - ATTIVATORI - REPRESSORI Basal factor binding sites Transcribed region ELEMENTO ENHANCER ELEMENTO DEL PROMOTORE PROSSIMALE

Il legame promotore RNA polimerasi richiede i fattori di trascrizione generali

Promotori ~200 bp gene

ATTIVITA’ 100% 100% 20% 1% 0% COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE Reporter gene eg CAT, luciferase 100% Reporter gene 20% Reporter gene 1% Reporter gene 0% Reporter gene

COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE ATTIVITA’ 100% Reporter gene eg CAT, luciferase 100% Reporter gene 400% Reporter gene 1% Reporter gene 0% Reporter gene

attivato basale Livello di trascrizione represso

Elementi del Core promoter • siti di legame per I fattori di trascrizione generali Che supportano un livello di trascrizione basale La regolazione della trascrizione e’ ottenuta dalla Azione di fattori di trascrizione gene-specifici Transcribed region

6 bp elemento ricco in purine RNAP II Inr DPE BRE TATA ~24bp TATA-box 8 bp elemento ricco in AT Bound by TFIID BRE 6 bp elemento ricco in purine Bound by TFIIB Inr DPE Bound by TFIID

TFIIF 2 subunits 2 subunits RNAP II TFIIA 2-3 subunits 12 subunits TFIIE TFIIF 2 subunits 2 subunits RNAP II TFIIA TFIID 2-3 subunits 12 subunits 10 subunits TFIIB TFIIH 1 subunit ~40 polipeptidi 9 subunits

RNAP II Inr DPE TATA-box 8 bp AT lega TFIID BRE 6 bp lega TFIIB Inr

TFIID TFIIF RNAP II ~24bp TATA BRE Inr DPE TFIIA TFIIB TFIIE TFIIH

TFIID contiene la TATA-Box Binding Protein TBP TFIID

TFIID e’ composta da vari TBP Associated Factors —TAFs -aiutano il posizionamento di TFIID riconoscendo L’elemento Inr -legano i fattori di trascrizione gene specifici -aiutano a decompattare la cromatina

TFIID ~24bp TATA BRE Inr DPE

TFIIA TFIID TFIIA -aumenta e stabilizza il legame di TBP al DNA TATA BRE Inr DPE TFIIA -aumenta e stabilizza il legame di TBP al DNA -interagisce con vari attivatori gene specifici Aiutandoli a legarsi ai vari TAF

TFIIB TFIID TFIIA TFIIB -si lega a TBP e richiama la polimerasi TATA BRE Inr DPE TFIIA TFIIB -si lega a TBP e richiama la polimerasi -Partecipa alla selezione del sito d’inizio e Stabilisce la direzione

TFIIF TFIIF TFIID TFIIA TFIIB RNAP II ~24bp TATA BRE Inr DPE TFIIA TFIIB Stabilizza il complesso di preinizio e induce Una torsione nel DNA

TFIIE TFIIF TFIID TFIIA TFIIB RNAP II ~24bp TATA BRE Inr DPE TFIIA TFIIB TFIIE Attira una elicasi ed insieme srotolano il Promotore. Stimola l’attivita’ chinasica di TFIIH

TFIIH TFIIF TFIID TFIIA TFIIB RNAP II TFIIH ~24bp TATA BRE Inr DPE TFIIA TFIIB TFIIE TFIIH Fosforila una delle subunita’ della polimerasi dando l’avvio alla trascrizione

— REGOLATORI GENE SPECIFICI Transcribed region SI LEGANO A SEQUENZE REGOLATORIE

Regolatori gene specifici • hanno una struttura modulare • contengono un dominio che lega il DNA • contengono uno o piu’ domini di attivazione trascrizionale • qualche volta contengono uno o piu’ domini di repressione • qualche volta contengono un dominio di dimerizzazione

(MADS box)

H O C N H Donatore Accettore

A D A M A A D M A D A D A A A A A D A A A A D A

Regolatori gene specifici Contengono un dominio che lega il DNA E un dominio di attivazione trascrizionale Transcribed region

Gli Attivatori come influenzano la trascrizione di un gene distante molte migliaia di nucleotidi? DNA loop

Enhancers- stimolano la trascrizione Attivatori si legano ad un sito specifico Il DNA si ripiega

Enhancers- stimolano la trascrizione Attivatori si legano ad un sito specifico Il DNA si ripiega Si forma il complesso nel promotore

Enhancers- stimolano la trascrizione Attivatori si legano ad un sito specifico Il DNA si ripiega Si forma il complesso nel promotore Si lega la RNA polimerasi Inizio della trascrizione

Controllo combinatoriale dell’espressione genica

Con poche proteine regolatorie si possono controllare un elevato numero di geni Diverse combinazioni producono fenotipi differenti

Heterodimerization of DNA binding proteins can alter their sequence specificity

Enhancer e Repressori RNAP promotore enhancer gene 10-50,000 bp repressore enhancer interagiscono con RNAP trascrizione repressore previene il legame dell’enhancer

Con poche proteine regolatorie si possono controllare un elevato numero di geni Diverse combinazioni producono fenotipi differenti

Recettori nucleari Fattori di trascrizione regolati da molecole idrofobiche Cambio dell’attivita’ Cambio della localizzazione cellulare

Recettori nucleari Il legame del ligando causa cambiamenti conformazionali TBP TAF RNA pol II RGRACANNNTGTYCY

Nuclear Receptors Legame dell’ormone Dissociazione da hsp90 GR GR GR TATA GR hsp90 GR GR Dissociazione da hsp90 GR hsp90 dimerizzazione Migrazione nel nucleo Legame al DNA

Regolazione mediante fosforilazione Ormoni attivano una chinasi La chinasi fosforila un fattore di trascrizione Il fattore e’ attivato

Cascata delle chinasi GF si lega al recettore - protein tyrosine kinase Il recettore dimerizza Il complesso fosforila MEKK – (MAP kinase kinase kinase) MEKK P MEKK SEK SEK P MEKK fosforila SEK – una MAP kinase kinase JNK P JNK P SEK fosforila JNK – una MAP kinase

Cascata delle chinasi nucleo TRE JNK attivata migra nel nucleo e fosforila il fattore di trascrizione C-JUN C-JUN dimerizza with C-FOS per formare AP-1 AP-1 attiva la trascrizione legandosi a –TGA(C/G)TCA- e interagendo con I fattori di trascrizione generali nucleo RNA pol II JNK P C-JUN P C-FOS P C-JUN TRE

Metilazione del DNA La citosina puo’ essere metilata: Risulta in una maggiore condensazione della cromatina La metilazione del DNA e’ coinvolta nell’inattivazione del cromosoma X

Trascrizione e struttura della cromatina Il DNA nella cromatina condensata non e’ accessibile La cromatina condensata (eterocromatina) e’ trascrizionalmente silente La condensazione della cromatina dipende ANCHE dalla acetilazione degli istoni

Acetilazione degli Istoni E’ una modificazione post-traduzionale Gruppi acetilici (CH3COO–) legati covalentemente a aminoacidi basici Neutralizzano le cariche positive Eliminano le interazioni ioniche con il DNA Diminuiscono la condensazione Associati con una attiva trascrizione

Acetilazione/Deacetilazione

Attivatori: acetilazione degli Istoni Alcuni attivatori attirano delle acetilasi Il macchinario di trascrizione puo’ accedere al DNA meno condensato

Alcune Istone Acetilasi (HAT) p300/CBP TAF II 250 Ambedue sono dei co-attivatori SAGA e’ a ponte tra un Fattore di Trascrizione e la TBP

Repressori: deacetilazione degli Istoni Alcuni repressori attirano delle deacetilasi Prevengono l’accesso del macchinario di trascrizione al DNA

Acetilazione/Deacetilazione

SWI/SNF in Lievito SWI/SNF sono regolatori positivi del gene HO (accoppiamento) e del gene SUC2 (utilizzo del saccarosio). Queste proteine catalizzano il rimodellamento ATP-dipendente del DNA

Macchinari di Rimodellamento Tutti contengono subunita’ simili a swi-2/snf NTP-binding proteins

http://www.uniroma2.it/didattica/biochimica/deposito/ Lez8-10.ppt Lez29-10.ppt (ancora da aggiungere)

Regolazione dell’Espressione Genica Puo’ essere regolata in una delle seguenti sei fasi: NUCLEUS CYTOSOL inactive mRNA degradazione DNA RNA transcript mRNA mRNA trascrizione Maturazione trasporto traduzione protein controllo dell’attivita’ inactive protein

Controllo della Traduzione 1. Repressione - es. Iron Response Element della ferritina 2. Stabilizzazione- es. IRE del recettore della transferrina Ferritina - Lega il Ferro e lo conserva Recettore della Transferrina (TFR)- trasporta il ferro nella cellula Se il Ferro e’ nella cellula - Si Ferritina, No TFR Se non c’e’ Ferro - Si TFR, No Ferritina Come viene regolato tutto questo?

1. Repressione :-Ferro, ferritina NO IRE-BP (cytosolic aconitase) Ferritin mRNA M M AUG m7G Coding region Iron Response Element 2. Attivazione:+ Ferro, ferritina SI Fe Fe Fe M Coding region AUG

1. Stabilizzazione:- Ferro, TFR SI IRE-BP (cytosolic aconitase) M TFR mRNA AUG m7G Coding region Iron Response Element 2. Degradazione:+ Ferro, TFR NO Fe Fe Coding region AUG

1. Stabilizzazione:- Ferro, TFR SI IRE-BP (cytosolic aconitase) TFR mRNA AUG m7G Coding region Iron Response Element 2. Degradazione:+ Ferro, TFR NO Fe Coding region AUG RNAse

Controllo dello Splicing: espressione di Fibronectine tessuto-specifiche Figure 11-24

Lo Splicing puo’ produrre anticorpi solubili o legati alla membrana dallo stesso gene Lo splicing alternativo puo’ produrre due tipi di anticorpo diversi con la stessa specificita’ Quando attivati dall’antigene i linfociti B cominciano a produrre anticorpi solubili Le forme secrete mancano degli esoni 7 e 8 che codificano per domini idrofobici Scan Hartwell Fig 8.18

Trasporto segnale-mediato attraverso il poro nucleare (NPC) The nuclear pore complex Figure 11-28

La proteina HIV Rev regola il trasporto dell’RNA virale non ancora maturo Figure 11-38

L’RNA Editing altera le sequenze dei pre-mRNA Figure 11-39

La deaminasi e’ presente mRNA editing Nel fegato Deamination of a C to a U creates a stop codon resulting in a truncated form of Apo B in the small intestine rather than the long form found in liver La deaminasi e’ presente solo nell’intestino Nell’intestino

No tRNA amino-acetilati Controllo della Traduzione da parte degli aminoacidi in lievito No Aminoacidi No tRNA amino-acetilati Gcn2p kinase GDP GDP P S51 a eIF2 eIF2 eIF2B GTP Translation competent eIF2