La ricerca delle aflatossine totali nel mais Con metodo HPLC

Il principio del metodo Per estrarre le aflatossine dal campione da analizzare si utilizza cloroformio; dopo aver filtrato, per purificare una parte del filtrato si utilizza una cartuccia di florisil e poi una di C18; La separazione e la determinazione successive si effettuano con sistema HPLC, utilizzando una colonna C18 a fase inversa, poi si effettua una derivatizzazione con una soluz. di iodio satura e, infine, una quantificazione, utilizzando un rivelatore a fluorescenza.

I reattivi Cloroformio stabilizzato con etanolo (allo 0,5 – 1%) Metanolo Propanone (acetone) Soluzione acetonelacqua (98:2) Soluzione acqualmetanolo (80:20) Soluzione acqualacetone (85:15) Eluente per HPLC, costituito da una soluzione acqualmetanolo/acetonitrile (130:70:40), i tre solventi devono essere per HPLC Soluzione di iodio satura in acqua (2 g di iodio in 400 ml di acqua, agitazione magnetica almeno per 2 ore e filtrare) Celite 545 o equivalente lavata con acido Cartucce di florisil Cartucce di C18 Soluzione standard di aflatossine

L’apparecchiatura Tritacarne Agitatore meccanico Bilancia analitica Rotavapor Carta da filtro a pieghe con diametro 24 cm o altra equivalente Filtro Millipore con pori di diametro 0,45 fvn Colonna di vetro, con diametro interno di 1 cm circa e lunghezza di 30 cm circa con attacco luer Rubinetto di nylon con attacco luer Siringa da 10 ml con attacco luer Cromatografo HPLC

L’apparecchiatura Colonna C 18 da 311 o da 5 u per HPLC Pompa per HPLC per la soluz. di iodio Collegamento a T in acciaio inox, Vmorto zero da 1/16 per 0.75 nun Spirale di reazione in teflon o in acciaio inox, avente dimensioni comprese tra 300 x 0.5 mm e 5000 x 0.5 mm Bagno termostato a olio o ad acqua a 60 °C con regolatore di temperatura (± 0.1 °C) Rivelatore a fluorescenza con λ di eccitazione = 365 nm ed emissione = 435 nm, mentre per gli strumenti a filtri l’emissione è < 400 nm; usare anche un regolatore di contropressione per evitare la formazione di bolle d’aria nella cella a flusso. Integratore elettronico

Avvertenza AF = aflatossine Le aflatossine sono cancerogene e quindi devono essere maneggiate con molta prudenza. L’analisi va quindi eseguita rigorosamente, sotto cappa, indossando guanti in lattice di gomma; utilizzare il più possibile degli standard di aflatossine in soluzione acquosa, evitando quindi quelli allo stato secco. Infatti queste sostanze, essendo particolarmente elettrostatiche, potrebbero diffondersi molto facilmente nell‘ambiente di lavoro. In caso di versamento accidentale di soluz. di AF, bisogna detergere con una soluz. di NaClO all'l %, lasciare reagire per 10 min e successivamente utilizzare una soluz. al 5% di acetone. Sciacquare tutta la vetreria utilizzata con MeOH, aggiungere la soluz. all’1% di NaClO e successivamente, passate due ore, aggiungere acetone fino al 5% del tot. Fare reagire per 30 min e poi lavare con cura.

Il procedimento: preparazione del campione ed estrazione Macinare completamente il campione e renderlo omogeneo Estrarre 50 g di campione, utilizzando 250 ml di CHCl3 e 25 ml di acqua distillata, in una beuta con tappo smerigliato, e aggiungere 25 g di celite, che funge da coadiuvante di filtrazione(cioè un materiale ausiliare nel proc. di filtraz. la cui funzione è di rendere incomprimibile e poroso il deposito di particelle solide che si accumula sul mezzo filtrante durante la filtrazione) Agitare per 30 minuti, filtrare con filtro a pieghe e poi raccogliere 50 ml di filtrato

Il procedimento: purificazione Collegare il rubinetto di nylon al gambo corto della cartuccia florisil, lavare quest’ultima e aspirare 10 ml di CHCl3 con la siringa e farne passare 8 nella cartuccia attraverso il rubinetto, per togliere l’aria Collegare il gambo lungo della cartuccia alla colonna di vetro e far passare gli altri 2 ml di CHCl3, attraverso la cartuccia, nella colonna; poi chiudere il rubinetto e staccare la siringa Aggiungere il filtrato al complesso colonna-cartuccia e lasciare filtrare per gravità, poi lavare con 5 ml di CHCl3 e poi con 20 ml di MeOH; poi scartare i componenti dell’eluito (attenzione: nel frattempo controllare che la colonna-cartuccia non vada a secchezza)

Il procedimento: purificazione Eluire le aflatoss. con 40 ml di acetonelacqua e raccogliere l’eluato Utilizzando il rotavapor, concentrare l’eluato, anche per eliminare i residui di acetone rimasti che porterebbero a perdita di analita nella cartuccia C18; riprendere questo residuo con 1 ml di MeOH e 4 di acqua Attaccare il rubinetto al gambo corto della cartuccia di C18 e far passare con la siringa 10 ml di MeOH, per togliere l’aria; aspirare 10 ml di acqua e farne passare 8 attraverso la cartuccia

Il procedimento: purificazione Collegare il gambo lungo della cartuccia a una colonna di vetro e far passare, attraverso la cartuccia, gli altri 2 ml di acqua, nella colonna; poi chiudere il rubinetto e staccare la siringa Mettere l’estratto ottenuto nella colonna e, con acqualmetanolo, lavare il pallone almeno 2 volte; lasciare filtrare per gravità; controllare che la colonna-cartuccia non vada a secchezza Eluire le aflatoss. con 50 ml di acqualacetone; raccogliere tutto l’eluato in un cilindro graduato; se ritenuto necessario, portare a 50 ml con acqua e mescolare.

Il procedimento: determinazione HPLC Predisporre il flusso della pompa a 0,5/0,3 ml/min, rispettiv. per colonna da 5 o da 311 u; la fase mobile (eluente) è acqualmetanolo /acetonitrile Il flusso dell’altra pompa dev’essere predisposto a 0,4/0,2 ml/min della soluzione satura di iodio per flussi rispettiv. per i flussi 0,5 e 0,3 ml/min della fase mobile Il rivelatore a fluorescenza va impostato alle λ di lavoro; regolare il detector impostando una deviazione di circa l’80% del fondo scala del registratore per 1 ng di AFB1

Il procedimento: determinazione HPLC Introdurre per iniezione nello strumento 250 μl degli standard e dell’estratto del campione Verificare la linearità della risposta fluorimetrica calcolando la curva di regressione lineare (y=ax+b) che si ottiene correlando la quantità x delle AF iniettate in ng con le aree proporzionali all’intensità di fluorescenza y

Calcoli II contenuto delle aflatossine totali del campione, in μg/Kg, è calcolato con la seguente formula:

Fonti ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA’, Metodi di analisi utilizzati per il controllo chimico degli alimenti, raccolta a cura di Massimo Baldini, Fabio Fabietti, Stefania Giammarioli, Roberta Onori, Leucio Orefice e Angelo Stacchini, 1996, v, 265 p. Rapporti ISTISAN 96/34 RICERCA SULLE CARATTERISTICHE DI FILTRABILITA’ DELLA BIRRA E OTTIMIZZAZIONE DEL PROCESSO DI FILTRAZIONE, tesi Presentata da: MICHELE SENSIDONI, Università di Bologna