WESTERN BLOT VANTAGGI: le proteine sono più accessibili; non c’è perdita di risoluzione se il trasferimento delle proteine viene eseguito correttamente; durata e stabilità delle membrane; una volta trasferite le proteine possono essere conservate per mesi; - il western blot può essere analizzato diverse volte
WESTERN BLOT La procedura può essere suddivisa in 3 passaggi: 1. separazione elettroforetica dei polipeptidi 2. trasferimento di tutte le proteine su una membrana appropriata 3. visualizzazione delle proteine di interesse
SEPARAZIONE DEI PEPTIDI una miscela di proteine può essere risolta mediante svariate tecniche elettroforetiche (gel non-denaturante, gel contenente SDS, gel per isoelettrofocalizzazione…) GEL DI POLIACRILAMIDE si ottiene dalla copolimerizzazione di acrilamide con N,N’- metilenbisacrilamide in presenza di un catalizzatore e di un iniziatore la porosità del gel dipende dalla concentrazione di acrilamide e bisacrilamide le proteine vengono separate sulla base delle loro dimensioni, in quanto la presenza di SDS conferisce a tutte le molecole la stessa carica
CELLA PER ELETTROFORESI VERTICALE SU GEL
TRASFERIMENTO SU MEMBRANA Per trasferire proteine dalla matrice del gel sono state utilizzate tre procedure 1. diffusione per contatto 2. capillarità o blotting per convezione 3. blotting elettroforetico
GENERALE: si ottiene utilizzando coloranti quali Comassie Blue, VISUALIZZAZIONE GENERALE: si ottiene utilizzando coloranti quali Comassie Blue, Ponceau Red, India ink, fast green e Aurodye Ponceau e fast green sono i più facilmente lavabili, quindi non interferiscono con eventuali detection specifiche SPECIFICA: si ottiene utilizzando sonde con isotopi radioattivi o mediante anticorpi specifici
METODI USATI PER LA VISUALIZZAZIONE SPECIFICA