Genetica delle malattie complesse LA MALATTIA DI ALZHEIMER Corso di Genetica Umana Facoltà di Medicina e Chirurgia dell’Università di Torino Alberto Piazza

La probabilità statistica che un individuo possa contrarre la sindrome è pari al 20% : il rischio di ricorrenza nei casi di famiglie con soggetti affetti è pari 50%

Caratteristiche generali della malattia (AD) Descrizione clinica - si tratta di una delle più comuni forme neurodegenerative, che inizia a manifestarsi fenotipicamente prima con una lieve ma progressiva perdita di memoria per poi esordire con una severa incapacità a ricordare. oltre alla perdita di memoria, AD è caratterizzato da demenza progressiva associata ad atrofia corticale cerebrale, formazione di placche b amiloidi extracellulari e fusi neurofibrillari intraneuronali. - altri sintomi comuni sono confusione mentale, mancanza di giudizio, disturbi nel linguaggio, stati di agitazione e persino allucinazioni... sono individui non più autosufficienti

Categorie della malattia di Alzheimer Type Proportion of all AD Sporadic 75% Associated with Down syndrome < 1% Familial Late onset familial AD (AD2) Early onset familial AD (AD3,AD1, e AD4) 25% - 15-25% - < 5%

Late-onset Familial Alzheimer Disease: Molecular Genetics Disease Name Proportion of all AD Gene Symbol Locus Normal Gene Product Test Availability AD2 15-25% ApoE (risk factor) 19q13 Apolipo protein E Clinical

Early-Onset Familial Alzheimer Disease (EOFAD): <5% (?) Molecular Genetics Disease Name Proportion of EOFAD Gene Symbol Locus Normal Gene Product Testing AD3 20-70% (?) PSEN1 14q24 Presenilin 1 Clinical AD1 10-15% (?) APP 21q21.3-q22 Amyloid precursor protein Research AD4 Rare (< 5%?) PSEN2 1q31-q42 Presenilin 2

Geni coinvolti PSEN1 (AD3) locus: 14q24 Varianti alleliche normali: Il gene PSEN1 noto anche come s182 (Sherrington et al., 1995) è composto da 10 esoni numerati da 3 a 12 e codifichi per una proteina per 467 r.a.a.. Gli esoni 8 ed una parte dell’esone 3 a livello di trascritto sono sottoposti a fenomeni di splicing alternativo, cosicché si presuppone l’esistenza di isoforme più corte per una stessa proteina. Inoltre si suppone che particolari fenomeni di splicing possano introdurre un ulteriore esone fra quelli già noti come 10 e 11. PSEN1 e PSEN2 sono geni altamente omologhi.

Prodotto normale: presenilina 1 (467 r.a.a.) - La proteina presenta 7-10 domini transmembrana idrofobici (probabilmente 8), N e C-terminali rivolti verso il citoplasma e piccoli loop rivolti verso il lumen del RE e dell’apparato del Golgi.

E’ omologa alla presenilina 2: differiscono principalmente per due loop a carattere idrofilico, l’uno sistemato all’N terminale, l’altro nel dominio citosolico fra il VI e VII dominio transmembrana (Doan et al 1996, Li & Greenwald et al 1996). Questo dominio citosolico contiene un sito di restrizione proteolitico (Podlisny et al 1997).

Correlazioni fra genotipo mutato e fenotipo gene PSEN1 (AD1): Prodotto genico alterato: ignoto! Più di 40 mutazioni per EOFAD sono state descritte in più di 50 famiglie: tutte le mutazioni sono missense eccetto una. Si tratta dell’eliminazione di un sito di splicing dove l’esone 9 è perduto, ma l’ORF rimane inalterata e la proteina si suppone più corta di 29 r.a.a.. In ultima analisi, 9 mutazioni si riscontrano nel dominio citosolico fra i domini 6 e 7, le altre negli altri domini idrofobici e a livello delle regioni di confine fra i domini idrofobici-idrofilici, specie nel dominio transmembrana 2.

mutazione Leu113Pro: demenza frontotemporale con cambiamenti nel comportamento e nella personalità oltre a differenze riscontrate in tema di età di insorgenza e durata di vita (Raux et al., 2000). mutazione Leu392Pro: sintomi di natura psichiatrica riscontrata in una famiglia (Tedde et al., 2000). delezione dell’esone 9: precoce paraparesi spastica (incapacità di muoversi) (CrooK et al. 1998, Verkkoniemi et al., 2000). formazione di placche amiloidi, fusi neurofibrillari e caratteri neuropatologici vanno associati a numerose mutazioni nel gene in questione (Gomez-Isla et al., 1999).

PSEN2 (AD4) locus: 1q31-q42 variante allelica normale: Come già detto tale gene è altamente omologo rispetto a PSEN 1. E’ costituito da 12 esoni, di cui 10 codificanti mentre i primi due codificano per il 5’ UTR (Levy-Lahad et al 1996). prodotto normale: presenilina 2 (448 r.a.a.) - sembra che codifichi per una proteina di 448 r.a.a. e presenti 8 domini transmembranari. - differisce da PSEN 1 per l’N terminale ed il dominio citosolico sistemato fra i domini transmembranari 6 e 7.

Correlazioni fra genotipo mutato e fenotipo gene: PSEN 2 (AD4) Prodotto genico alterato: ignoto! Sono state descritte solo due tipi di mutazione per la forma EOFAD ed interessano un range poco definito di età di insorgenza (40-75 anni): una mutazione è stata riscontrata in molte famiglie Volga German (origine: Europa Orientale) a conferma dell’effetto fondatore in quella popolazione: Asn141Ile (Levy-Lahad et al 1995) L’altra mutazione riguarda una famiglia italiana: Met239Val (Rogaev et al 1995)

Beyer et al 1998, Cruts et al 1998 riportano altre due possibili mutazioni responsabili. - mutazioni nei domini transmembra 2,4 e 6 non solo in PSEN1 ma anche in PSEN2 comportano differenze in tema di età di insorgenza e di durata di vita (Lippa et al., 2000).

APP (AD1) Proteina Precursore per peptidi Amiloidi locus: 21q21.3-q22 Variante allelica normale: Il gene presenta 19 esoni e codifica per una proteina precursore di peptidi β-amiloidi (APP). Prodotto normale: proteina A4 amiloide AD (APP) (695/751/770 r.a.a.) Prodotto genico alterato: ignoto!

Prodotto normale: Proteina A4 amiloide AD (APP) (695/751/770 r.a.a.)

Intracellular pathway implicated in pathogenesis of AD involves the metabolism of APP - APP è sintetizzata nel RE e nell’apparato del Golgi, dalla quale la molecola di membrana si dirige verso la superficie cellulare per poi essere reinternalizzata per endocitosi. - Si suppone che interagisca con le PSEN1, ritenute come le probabili responsabili del traffico della molecola oppure della sua associazione con proteasi, note come α, β, e γ.

APP mutations associated with AD

ApoE (AD2 e AD1?) locus: 19q13 Varianti alleliche normali: Il gene presenta quattro esoni e codifica per una proteina di 299 r.a.a.. Presenta tre forme alleliche: e2, e3 ed e4. Prodotto normale: ApoE (299 r.a.a.) E’ espressa in quasi ogni tessuto (SNC compreso) e principalmente nel fegato. Strutturalmente presenta un lipid binding domain al C-term ed un receptor binding domain all’N-term. Ciò conferisce ad essa la capacità di trasportare i lipidi, renderli solubili nel sangue ed internalizzarli a livello cellulare.

Le funzioni di APOE nel cervello non sono state ancora ben identificate, ma sono emerse alcune ipotesi…

La presenza dell’isoforma ApoE e4 all’interno del neurone, causerebbe la fuga della tau protein dal dominio protettivo di ApoE e4 e la sua successiva omodimerizzazione in filamenti elicoidali appaiati (PHF) e a seguito del loro accumulo, la formazione di fusi neurofibrillari intracellulari

ApoE (AD2 e AD1?) locus: 19q13

Polimorfismo nell’ ApoE (Wild type)

In sintesi, esistono due ipotesi principali: (a) Amyloid hypothesis: Amyloid precursor protein (APP) b-amyloid Tau protein Amyloid plaques Neurofibrillary tangles Nerve cell death Dementia

(b) Tau protein hypothesis: sono fenomeni indipendenti! Amyloid Precursor protein (APP) b-amyloid Amyloid plaques Nerve cell death Dementia Tau protein Neurofibrillary tangles Causal link Predicted link to AD

Diagnosi Per stabilire un sottotipo specifico di FAD per un dato paziente in genere sono necessari dettagliate storie familiari e l’impiego di test genetici molecolari. Storia familiare Sono richieste almeno la storia familiare di almeno tre generazioni in particolare la storia degli individui affetti (discriminante: età dell’insorgenza). LOFAD: dopo 65 anni EOFAD: prima dei 65 anni Tutti con molteplici casi di AD familiari

LOFAD (AD2) (ApoE) Risulta ben documentata l’associazione fra Late-onset Familial AD (AD2) e l’allele e4 di ApoE, che presenta un grado di associazione piuttosto elevato, ma sotto il profilo diagnostico e di stima del rischio ancor oggi i test sono poco attendibili (Roses 1995): - in generale si può dire che il grado di associazione fra ApoE e4 e AD è particolarmente elevato quando il soggetto affetto presenta casi di demenza nella storia familiare, ma conoscere il genotipo di Apo E di un soggetto è un dato di indicativo, ma non predittivo e perciò non permette ancora di formulare diagnosi ed elaborare forme di prevenzione: la forma allelica e4 e genotipica e4/e4 non sono una condizione necessaria e sufficiente affinché insorga AD!

Percent of ApoE Genotypes in Controls and Patients with AD 2 Normal Controls (n = 304) All Patients with AD (n = 233) Patients with AD and Positive Family History of Dementia (n = 85) 2/2 1.3% 0% 2/3 12.5% 3.4% 3.5% 2/4 4.9% 4.3% 8.2% 3/3 59.9% 38.2% 23.5% 3/4 20.7% 41.2% 45.9% 4/4 0.7% 12.9% 18.8%

Percent of ApoE Genotypes in Controls and Patients with AD 2

Il più alto livello di associazione fra l’allele e4 e AD è il genotipo e4/e4: in termini di frequenza genotipica e4/e4 è presente in circa 1% della popolazione normale e circa il 19% della popolazione con AD familiare. In termini invece di frequenza allelica, si parla del 36% in AD sporadici, 46% in AD2 (LOFAD) e 14% in soggetti sani. In soggetti con diagnosi clinica per AD, la probabilità che la diagnosi sia corretta cresce del 97% in presenza del genotipo ApoE e4/e4. Ma ciò che conta è che soggetti affetti non presentino l’allele e4 e che l’allele e2 non si annovera come causa di insorgenza per AD per soggetti non facilmente classificabili come affetti da AD. per questo motivo, test eseguiti su ApoE risultano poco specifici! Si tratta solo di dati indicativi insufficienti per formulare diagnosi!

ApoE allele frequencies in Controls and Patient with AD Normal Controls (n=304) All Patients with AD (n=233) Patients with AD and Positive Family History of Dementia (n=85) 2 9.0% 3.9% 5.9% 3 76.5% 60.5% 48.2% 4 13.7% 35.6% 45.9%

ApoE Allele Frequencies in Controls and Patient with AD

EOFAD AD3: sono disponibili test genetici molecolari ma sono anch’essi insufficienti nel predire l’età di insorgenza, la gravità e la velocità di progressione della sindrome in soggetti asintomatici. I test clinici per le mutazioni in PSEN 1 mettono in evidenza che il 20-70 % dei soggetti affetti da EOFAD presentano come sottotipo AD3. AD1: il test relativo non è preditivo e ricopre il 10-15 % dei casi di EOFAD (Campion et al 1999). L’allele e4 ApoE potrebbe esservi associato.

AD4: il test relativo non è preditivo e ricopre meno del 5% dei FAD AD4: il test relativo non è preditivo e ricopre meno del 5% dei FAD. Infatti è stato rilevato solo in poche famiglie molte delle quali sono tedesche originarie del Volga (Volga German ancestry), altre residenti attualmente in U.S. (Bird et al 1988), due di origine italiana (Rogaev et al 1995, Finckh et al 2000) ed un solo paziente spagnolo (Beyer et al 1998).

Stime sul rischio di incidenza AD sporadico Rischio globale di contrarre la sindrome nell’arco di una vita è pari al 10-20% perciò si può dire che AD è una sindrome piuttosto diffusa. Mentre sussiste una stretta associazione tra AD e l’allele e4 ApoE, la genotipizzazione di ApoE non è utile per predire AD in soggetti privi di sintomi. Si parla di un elevato rischio in donne che sono omozigoti per il suddetto allele (Breitener et al 1999). AD e sindrome di Down I membri di una famiglia con individuo Down non hanno un aumento del rischio di insorgenza.

LOFAD (AD2) Come già detto, riguarda le famiglie con storie importanti e la cui insorgenza risale ad un’età superiore ai 65-70 anni. Il fatto di avere due o più soggetti affetti in famiglia fa accrescere di molto il rischio rispetto ai casi di AD sporadici, anche se la grandezza del suddetto aumento non è ancora quantificabile. Indicativamente: Heston et al 1981 riportano i casi di soggetti che hanno un fratello con insorgenza ad un’età minore dei 70 anni e uno dei due genitori affetti: il rischio di incidenza è pari al 35-45%. Bird et al. affermano che il fatto di avere entrambi genitori affetti implichi un rilevante aumento del rischio di incidenza.

EOFAD (AD3,AD1 e AD4) Riguarda in genere i casi di soggetti la cui insorgenza avviene in età giovanile e che presentano almeno un genitore o un parente affetto. Esistono anche casi di EOFAD apparentemente sporadici o meglio casi in cui ci siano casi precedenti al probando (motivi vari: decesso prematuro, adozione, diagnosi errate,…oppure semplicemente una mutazione senza precedenti). Il rischio di incidenza per i fratelli del probando dipende dallo stato genetico dei loro genitori. Se uno dei genitori del probando presenta un allele mutato, il probabilità per i fratelli e per i figli del probando è pari al 50%.

E’ comune opinione che il test per l’ApoE non dovrebbe essere preso in considerazione come strumento predittivo per soggetti asintomatici. Infatti, un individuo asintomatico che presenti un genotipo e4/e4 ApoE dovrebbe avere un rischio di incidenza globale pari al 30% (Breitner et al 1996): dal punto di vista clinico tale rischio non è molto utile. Il rischio infatti dipende anche dal sesso del soggetto: - Breitner et al. affermano che una donna con genotipo e4/e4 ApoE ha il 45% di probabilità di sviluppare AD dai 73 anni in poi, mentre nel caso di un uomo la probabilità scende al 25%. - considerando il fatto che un individuo sia in uno stato di eterozigosi, il rischio decresce e l’età di insorgenza possibile si aggira intorno agli 87 anni. - l’assenza dell’allele e4 scosta l’età di insorgenza intorno ai 95 anni facendo decrescere ulteriormente il rischio.

Conclusioni I progressi compiuti nel settore della genetica medica e molecolare si stanno ovviamente trasferendo nella pratica clinica. Nelle forme famigliari, che si trasmettono con modalità autosomica dominante, il rischio di ricorrenza della malattia è pari al 50%. Questo rischio può essere modificato se si riesce ad identificare nella famiglia la mutazione responsabile di malattia.