Ibridazione degli acidi nucleici e misurazione dell’espressione di un gene Condizioni che possono destabilizzare la doppia elica provocando la separazione delle due catene (denaturazione) Alte temperature pH alcalino estremo (>13) Bassa forza ionica [Na+] Presenza in soluzione di sostanze che rompono i ponti a idrogeno (urea, formamide).

La denaturazione della doppia elica si accompagna a grosse variazioni delle proprietà fisiche delle soluzioni di DNA Diminuzione della viscosità Aumento di assorbanza a 260nm Variazione dell’attività ottica

Curve di denaturazione

La denaturazione non è un processo irreversibile. Infatti se dopo la separazione delle eliche si fa scendere gradualmente la temperatura, le singole eliche complementari si possono riappaiarea doppia elica può riformarsi. Questo processo si chiama ibridazione.

La discesa graduale della temperatura e la permanenza delle molecole per un certo tempo pochi gradi al di sotto della temperatura di denaturazione sono fondamentali affinchè ci possa essere ibridazione, processo dipendente dai moti di agitazione termica. Se dopo la denaturazione la soluzione viene portata a bassa temperatura non si ha ibridazione, ma stabilizzazione della struttura secondaria delle singole catene.

Per mezzo dell’ibridazione si possono formare delle doppie eliche di DNA-DNA, DNA-RNA o RNA-RNA. La condizione fondamentale perché ciò avvenga è che in soluzione si mettano molecole con sequenza complementare (antiparallele). L’ibridazione è una forma di riconoscimento molecolare estremamente specifica.

In condizioni opportune di temperatura e forza ionica (stringenza) si possono ottenere anche delle eliche in cui sono tollerati degli appaiamenti non perfetti

Effetti della stringenza di ibridazione

Cinetiche di rinaturazione

Sintesi chimica oligonucleotidi: Con questo sistema si possono sintetizzare in vitro singoli filamenti di DNA di grandezza compresa tra 6 e 100 nucleotidi

Metodi di marcatura degli acidi nucleici

Le DNA polimerasi batteriche possono essere purificate e utilizzate per sintetizzare DNA in vitro dATP dCTP dGTP dTTP Primer sintetico 3’ 5’ DNA polimerasi DNA stampo (singolo filamento) 5’ 3’

Le DNA polimerasi batteriche possono essere purificate e utilizzate per sintetizzare DNA in vitro 5’ 5’ 3’ DNA stampo (singolo filamento)

Le DNA polimerasi batteriche possono essere purificate e utilizzate per sintetizzare DNA in vitro 5’ 3’ 5’ 3’

Traccianti utilizzati Nucleotidi marcati con isotopi radioattivi

Traccianti utilizzati Nucleotidi marcati con sostanze non radioattive

Traccianti utilizzati Nucleotidi marcati con sostanze non radioattive Fluorocromi (marcatura diretta) Enzimi (perossidasi, fosfatasi alcalina) Digossigenina (riconosciuta da anticorpi specifici marcati con fluorocromi o enzimi) Biotina (riconosciuta da avidina marcata con fluorocromi o enzimi)

Traccianti utilizzati Fluorocromi

Marcatura di DNA mediante random priming

Esempio di ibridazione: FISH (fluorescent in situ hybridization)

Come si fa a vedere se un gene è espresso?

Purificazione dell’mRNA (non obbligatoria) L’mRNA rappresenta il 2-4 % dell’RNA totale presente nelle cellule. L’mRNA può essere purificato mediante cromatografia di affinità con oligo-dT legata a diversi supporti solidi. L’mRNA purificato prende anche il nome di poly-A+, e rappresenta la base per diverse procedure di analisi di espressione, oltre che per la sintesi del cDNA necessario alla produzione di genoteche.

Misurazione espressione a livello della proteina 2D-Gel electrophoresis