Sistema LightScanner® Rilevazione delle mutazioni e genotipizzazione ad alta resa Distributore per l’Italia

Sistema LightScanner La caratteristica che contraddistingue il sistema LightScanner è la tecnica High Resolution Melting (Hi-Res Melting™). Hi-Res Melting è una tecnica post PCR per la rilevazione e lo scanning delle mutazioni omogenee. VELOCE – risultati in meno di 5 minuti. SEMPLICE – nessun procedimento post PCR. ECONOMICO – costi nettamente inferiori rispetto alla concorrenza Distributore per l’Italia

Scanning con Hi-Res Melting Tubo-chiuso dye dsDNA prima della PCR Nessun processamento, aggiunte o separazioni Nessuna esposizione esterna Rapido 5-10 min per 96/384 campioni Non distruttivo Se necessario, è possibile eseguire procedimenti downstream (ex: sequenziamento) Manutenzione minima Smaltimento dei rifiuti non dispendioso Distributore per l’Italia

Componenti essenziali della Hi-Res Melting Dye specifico per DNA a doppio filamento LCGreen Plus™, specifico per la rilevazione degli eteroduplex che si formano durante la PCR, è prodotto esclusivamente da Idaho Technology. Strumentazione ad alta risoluzione Lo strumento LightScanner è progettato specificatamente per le applicazioni Hi-Res melting Distributore per l’Italia

Dye LCGreen® Plus LCGreen Plus rileva gli eteroduplex, a differenza dei dye usati tradizionalmente per la real-time PCR (ex: SYBR Green I) Distributore per l’Italia

LC Green – un dye “di saturazione” Dye non saturante Dye saturante Distributore per l’Italia

Strumento LightScanner Disponibile per piastre da 96 o da 384 pozzetti Uniformità sulla piastra +/- 0.15°C 100 punti di rilevamento raccolti per °C a 0.10 °C/sec Distributore per l’Italia

Tecnica Hi-Res Melting Amplificazione dei campioni con il dye LCGreen 2 ore inclusa la preparazione della PCR Melting dei campioni 5-10 minuti Analisi dei dati Recupero dei campioni per il sequenziamento (se necessario) 30-60 minuti Distributore per l’Italia

Heterozygote Amplification Observed Combination of 4 Duplexes Two Homoduplexes Two Heteroduplexes Distributore per l’Italia

Analisi di melting Distributore per l’Italia

Analisi di melting Distributore per l’Italia

Analisi di melting Distributore per l’Italia SNP 1 homozygote

Analisi di melting Distributore per l’Italia SNP 1 + 2 SNP 1 SNP 2 SNP 1 homozygote Distributore per l’Italia

Prodotto di 100 bp C/C Omozigote C/G Eterozigote C/T Eterozigote C/A Eterozigote Gli omozogoti vengono facilmente distinti dagli eterozigoti Eterozigoti diversi tra loro tracciano profili di melting unici Distributore per l’Italia

Rilevazione delle varianti omozogotiche Distributore per l’Italia

“Blinded Samples” di tumore Distributore per l’Italia

Dosaggio del target Distributore per l’Italia

Utilizzo di un “toolbox” DNA come sistema modello per l’individuazione delle mutazioni Highsmith et al., Electrophoresis (1999) Plasmidi costruiti con un contenuto in GC di 40%, 50%, e 60% e con A, C, G, o T in posizione uno Primers di PCR spaziati di 50 bp su ogni filamento X            Reed and Wittwer Clin. Chem. 2004, 50(10): 1748-54 Distributore per l’Italia

Sensibilità e specificità Sensibilità e specificità in funzione della lunghezza del prodotto N=1248, ogni strumento Tre target differenti Tutti gli SNPs e i WTs possibili Clin Chem. 2004;50:1748-54. Distributore per l’Italia

Benefici del sistema Hi-Res Melting Hi-Res Melting utilizzando strumenti per real-time PCR Gli strumenti per real-time PCR in commercio non permettono il controllo preciso della temperatura, l’acquisizione della totalità dei dati e non sono dotati di un software di analisi che garantisca un corretto sviluppo del metodo. Caratterisica LightScanner Piattaforme Real-time Risoluzione Alta Bassa Software di analisi specifico per la Hi-Res Melting Sì No Compatibilità con la fluorescenza Non tutti sono compatibili con il dye LCGreen Risultato in 5 minuti >30 minuti Distributore per l’Italia

Benefici del sistema Hi-Res Melting La capacità dell’analisi di melting dipende direttamente dalla risoluzione dello strumento utilizzato La precisione delle curve di melting permette l’identificazione di campioni genotipicamente diversi tra loro Curve melting normalizzate di un amplicone di 110-bp in presenza del dye LCGreen Plus. I dati mostrano i vantaggi del sistema Hi-Res Melting. I profili reali di Hi-Res Melting permettono la distinzione tra campioni wild type (AA) in verde, mutanti eterozigoti (AT) in blu e mutanti omozigoti (TT) in rosso. Distributore per l’Italia

Processamento del campione Tempo necessario per processare 96 campioni Presupposti: DHPLC a 2 temperature Sequenziamento in una direzione con utilizzo del sequenziatore a 48 capillari e del software per la rilevazione Data Taken from Dr C Taylor: Cancer Research UK Clinical Centre, St James's University Hospital, Leeds, UK Distributore per l’Italia

Costi Costi per DHPLC, FSSCP e sequenziamento basati sui costi reali per campioni processati nel biennio 2002-2003. Costi per la Hi-Res Melting basati sul costo reale e stimato dei consumabili Data Taken from Dr C Taylor: Cancer Research UK Clinical Centre, St James's University Hospital, Leeds, UK Distributore per l’Italia

È possibile eliminare il 99% dei sequenziamenti? ~ 90% Normale Scanning dei frammenti di PCR per le varianti Wild type ~10% Anomalo Genotipizzazione con sonda non marcata delle varianti note Variante genotipizzata ~ 9% Identificato ~1% Non identificato Sequenziamento del DNA Distributore per l’Italia

Conclusioni Nel sistema LightScanner sono già incluse tutte le componenti necessarie al successo nelle applicazioni Hi-Res Melting Dye LCGreen Plus Master Mix per LightScanner Strumento LightScanner Software disponibile per la progettazione di test, la rilevazione delle mutazioni e la genotipizzazione Protocolli on-line Risparmio di tempo e denaro Alta resa nella rilevazione delle mutazioni e nello scanning dei geni Distributore per l’Italia

Labogen S.r.l. (distributore per l’Italia) Per maggiori informazioni sul sistema LightScanner Vi preghiamo di contattare: Labogen S.r.l. (distributore per l’Italia) Tel.: 02.9390.7515 – Fax: 02.9390.9417 info@labogen-srl.it Distributore per l’Italia