Terapia Genica

Può essere in vivo o ex vivo Terapia genica Insieme di procedimenti atti a a curare o ad alleviare una malattia modificando geneticamente le cellule dei pazienti. Può essere in vivo o ex vivo

Vantaggi teorici della terapia genica Correzione radicale dei difetti Possibilità di agire su meccanismi molecolari per i quali risulta estremamente difficile sviluppare farmaci specifici Vantaggi economici (se fosse permanente eviterebbe la necessità di trattamenti ripetuti)

Limitazioni della terapia genica Rischio troppo elevato in presenza di terapie alternative Mancanza di efficacia dovuta a problemi tecnici (inefficiente trasferimento genico, inattivazione del gene terapeutico) Costi elevati Alto rischio di effetti indesiderati (espressione non regolata, mutagenesi inserzionale, passaggio delle modifiche alla linea germinale)

Attuali problemi tecnici della terapia genica Efficienza di trasferimento genico Selettività del sistema di trasferimento Espressione instabile nel tempo Espressione non regolata Reazioni del sistema immunitario Possibili interferenze con il genoma (mutagenesi inserzionale) Problemi etici

Quando si può pensare di curare una malattia con la terapia genica allo stato attuale? Malattia pericolosa per la vita, ma dagli effetti potenzialmente reversibili. Gene clonato. Disponibile sistema di trasferimento genico efficiente per le cellule affette, che garantisca espressione stabile nel tempo. Non richiesta regolazione precisa del gene in questione.

Incremento della dose genica Strategie terapeutiche Incremento della dose genica

Inibizione mirata dell’espressione genica Strategie terapeutiche Inibizione mirata dell’espressione genica siRNA Strategia utile per le patologie causate dalla presenza di mutazioni ad effetto dominante o dominante negativo.

Strategie terapeutiche Uccisione diretta di cellule patologiche (in genere tumorali) Gene che codifica un oncosoppressore Virus oncolitico

Strategie terapeutiche Uccisione di cellule patologiche mediata dal sistema immunitario (tumori)

Terapia genica del cancro: potenziamento della risposta immune

Principali malattie oggetto di studio per la terapia genica: Deficit Incidenza Cellule bersaglio GENETICHE SCID Adenosina deaminasi IL-2R gamma Rara Midollo osseo Linfociti T Emofilia A e B Fattori VIII o IX 1:10,000 maschi Fegato, musc. Ipercolesterolemia familiare Recettore per LDL 1:1,000,000 Fegato Fibrosi cistica Gene CFTR 1:3,000 caucasici Vie resp. Emoglobinopatie (tal., SCA) Difetti in - o -globina Fino a 1:600 Enfisema ereditario 1-antitripsina 1:3,500 Polmoni,fegato ACQUISITE Cancro Vari > 1 milione/anno Vari tipi Malattie neurologiche Parkinson, Alzheimer,SLA 1 milione/anno Neuroni, glia Malattie infettive AIDS, epatite C CellT, MF,feg. Malattie dell’occhio Retinopatia diabetica Degenerazione maculare Epitelio retinico

Primo prodotto di terapia genica disponibile in commercio: Adenovirus esprimente p53 contro carcinomi sqamo-cellulari di testa e collo, licenziato in Cina dall’Industri cinese Shenzen SiBiono (2003) Prodotto simile che sta per essere registrato negli USA (ora in fase III della sperimentazione clinica contro carcinomi sqamo-cellulari di testa e collo, tumori del polmone e della mammella): -> Adenovirus per p53, Advexin Si ritiene che l’Advexin sara’ il primo farmaco di terapia genica registrato in USA, probabilmente nel 2007 o 2008.

Trial clinico per deficit ADA deficit di adenosina deaminasi Trial on 2 ADA patients. Started 1990. 2 years treatment. Results published in 1995 Science, Blaese et al

Trial clinico per SCID protein expression A. PCR: detection of gc DNA B: RT PCR Detection of gc RNA protein expression Lymphocyte subsets

Trial clinico per SCID Gene therapy of Human Severe Combined Immunodeficiency (SCID)-XI Disease: Trial successivi hanno dimostrato successo nell’esprimere gc e correggere il difetto immunitario in 9 pazienti su 10 trattati Tuttavia, dopo 3 anni i due pazienti piu’ giovani (1 e 3 mesi al tempo del trattamento) hanno improvvisamente sviluppato proliferazione clonale di linfociti T maturi (Science 2003).

Come faccio entrare il DNA nelle cellule, e cosa gli succede quando è entrato? Vettori non virali Vettori virali con opportune sequenze regolatrici Integrazione casuale o sito-specifica

Vettori virali: i Retrovirus Genoma: RNA singolo filamento. Integrazione casuale nel genoma (mutagenesi inserzionale). Difficile produrli in grandi quantità (titolo elevato). Successo della terapia dipendente dalla trasduzione delle cellule staminali. Poco immunogeni. L’espressione può andare incontro ad attenuazione nonostante la persistenza del virus nel genoma. In assoluto sono i vettori più utilizzati per la terapia genica. Possono infettare solo cellule proliferanti

Lentivirus Genoma ad RNA. A differenza degli altri retrovirus possono infettare cellule proliferanti e post-mitotiche. Scarsissime reazioni immunologiche. Elevata efficienza di trasduzione e persistenza dell’espressione. Ottime prospettive per la terapia genica in vivo. Integrazione casuale (mutagenesi inserzionale)

Adenovirus

Adenovirus Genoma di DNA doppio filamento. Possono infettare cellule proliferanti e post-mitotiche. Non si integrano, ma vengono mantenuti in forma episomica. Pertanto non determinano mutagenesi inserzionale, ma sono necessari trattamenti ripetuti. Relativamente facile produrli in grandi quantità (titolo elevato). Forti reazioni immunologiche.

Vettori adenovirali Sviluppo di nuove generazioni di vettori allo scopo di ridurre immunogenicità e aumentare le dimensioni degli inserti.

Terapia cellulare Allotrapianto: cellule provenienti da un donatore della stessa specie Xenotrapianto: cellule provenienti da animali di specie diverse Autotrapianto: cellule provenienti dallo stesso paziente

Le cellule staminali

Le cellule staminali

La clonazione animale Dolly

Perché qualcuno sta pensando seriamente alla clonazione umana? (clonazione terapeutica) Il problema principale della terapia cellulare è l’istocompatibilità ->rigetto La clonazione permetterebbe di ottenere cellule staminali totipotenti dotate delle stesse caratteristiche antigeniche del paziente, da usare per il trapianto direttamente o previa correzione del difetto tramite terapia genica.

Perché qualcuno sta pensando seriamente alla clonazione umana? Cellula somatica normale Ovocita Cellule somatiche paziente Terapia genica Cellule totipotenti sane istocompatibili