Prognostic and predictive markers and the role of genomics & proteomics Stefano Iacobelli Medical Oncology University G. D’Annunzio, Chieti-Pescara Grazie all’affinamento delle tecniche sperimentali, in questi ultimi 30 anni, la ricerca oncologica ha identificato un’ampia serie di variabili biologiche che oltre a far luce sui meccanismi molecolari alla base del processo neoplastico, potrebbero trovare utile applicazione clinica a livello diagnostico o come fattori prognostici e predittivi per identificare sottogruppi di pazienti con differenze clinicamente rilevanti in termini di decorso di malattia o meglio indirizzare la scelta terapeutica in gruppi di pazienti già definiti in base ad altri fattori clinico-patologici (diapo 1). Il crescente interesse clinico per questi ipotetici fatori prognostici e predittivi è dimostrato anche dalle numerose pubblicazioni scientifiche relative a studi di valutazione dell’utilità clinica di queste nuove variabili biologiche che, nel caso del carcinoma mammario, hanno raggiunto nel 2003 la cifra complessiva di 220 (diapo 2). Per fattore prognostico si intende una variabile biologica che, valutata in un determinato momento della storia naturale del tumore (alla diagnosi, alla ripresa di malattia) sia in grado di fornire indicazioni prospettiche sul decorso clinico della malattia; per fattore predittivo si intende invece una variabile biologica in grado di fornire indicazioni sulla possibilità di un paziente di rispondere ad una data terapia e che quindi permette di selezionare “a priori” quei pazienti che potranno trarre beneficio da uno specifico trattamento (ormonale o chemioterapico) diapo 3). Un fattore prognostico puro sarà in grado di discriminare pazienti a buona o a cattiva prognosi indipendentemente dall’eventuale terapia applicata; tipico esempio è lo stato linfonodale ascellare nel carcinoma della mammella il cui impatto sulla prognosi è del tutto indipendente dalla terapia applicata: pazienti con metastasi linfonodali presenteranno comunque un rischio di ripresa più elevato e una percentuale di sopravvivenza inferiore a quelli delle pazienti senza invasione linfonodale (diapo 4). Al contrario, un fattore predittivo puro sarà in grado di predire la risposta ad un dato trattamento fisico o chimico senza però dire nulla sulla prognosi del paziente: è il caso dell’espressione di bax, una proteina pro-apoptotica la cui over-espressione è stata vista associata ad una migliore risposta alla chemioterapia (diapo 4). Allo stesso modo l’overespressione di HER-2/neu (membro della famiglia dei recettori per i fattori di crescita cui appartiene anche l’EGF-R) è indice di una possibile risposta alla terapia con Herceptin (l’anticorpo monoclonale che specificamente riconosce la molecola recettoriale bloccandone l’attivazione costitutiva). Un fattore prognostico sarà inoltre più forte quanto sarà in grado di selezionare in modo netto le pazienti a miglior o peggior prognosi nell’ambito di una categoria di rischio definita in base ad altri fattori clinico-patologici; avrà quindi una rilevanza prognostica forte quel biomarcatore in grado di spostare una paziente di due classi di rischio, mentre avrà una rilevanza prognostica molto limitata se non sarà in grado di discriminare se non all’interno della stessa classe di rischio (diapo 6). Purtroppo però la maggior parte dei biomarcatori non ha un comportamento netto e si comporta come fattore prognostico/predittivo misto con la prevalenza di una o dell’altra caratteristica a seconda del contesto clinico. Ne è un tipico esempio lo stato recettoriale che identificato inizialmente come puramente prognostico ha successivamente acquisito maggiore rilevanza come predittore di risposta alla terapia ormonale. (Diapo 5) Analogamente, l’elevata attività proliferativa, oltre ad essere indicativa di una maggiore aggressività della malattia e quindi associata ad una peggior prognosi, è anche indicativa di una possibile risposta ad una terapia farmacologia finalizzata a colpire le cellule attivamente proliferanti (CMF) (diapo 5). Nel caso del carcinoma mammario, molti degli ipotetici biomarcatori finora identificati rientrano nelle sei classi in cui si possono classificare le capacità acquisite da una cellula tumorale (diapo 7) anche se solo per alcuni ne è stata validato l’impiego nella pratica clinica (diapo ex22). E’ il caso dei recettori per gli ormoni steroidei in grado di identificare, da un lato, le pazienti a miglior prognosi in assenza di trattamento adiuvante (diapo 9) e dall’altro quelle responsive alla terapia ormonale (diapo 10). Analogamente, gli indici di proliferazione (come per esempio la valutazione dell’incorporazione di timidina marcata da parte della cellula) è i grado da un lato di identificare le pazienti la cui malattia è più aggressiva e dall’altro le pazienti suscettibili di risposta a terapia con farmaci in grado di colpire le cellule attivamente proliferanti (diapo 11). Più discusso seppure promettente l’uso quali fattori prognostici/predittivi dell’ovrexpressione di oncogeni o di recettori per fattori di crescita (diapo 12); dell’alterazione nell’espressione di oncosoppressori come p53 (diapo 13) o di proteine che regolano il normale svolgimento del ciclo cellulare (p27 e ciclina E) (diapo 14 e 15), dell’overespressione di molecole associate all’apoptosi (diapo 16), di quelle associate all’attivazione dell’angiogenesi (VEGF diapo 17) o all’invasione e metastatizzazione (uPAI e PAI1 diapo 18) e di molte altre delle quali però non è ancora definitivamente accertato il potenziale ruolo clinico (diapo 19). La mancanza di un rapido trasferimento delle conoscenze acquisite dagli studi di base alla clinica è soprattutto legata ad una serie di criticità connesse agli studi translazionali tra i quali i più importanti sono: le limitate dimensioni delle casistiche studiate; l’eterogeneità per stadio clinico o tipo di trattamento, rilevante soprattutto per gli studi retrospettivi; le differenze nelle procedure di valutazione biologica della variabile o di analisi statistica dei risultati ottenuti; le informazioni spesso insufficienti che a volte rendono difficoltoso il confronto dei risultati ottenuti in studi diversi (diapo 20). Tali criticità hanno indotto la comunità scientifica a definire delle linee guida per valutare l’utilità clinica di un biomarcatore in base al tipo di studio pianificato (prospettico o retrospettivo) e all’analisi statistica applicata (diapo 21). Dal punto di vista biologico, però sempre più emergente è il problema di dare un senso unitario alla mole considerevole di informazioni che si vanno accumulando e grazie al crescente sviluppo tecnologico si sta cercando di passare da un approccio riduzionistico (gene per gene) ad una visione più olistica in cui non venga più presa in considerazione la singola variabile biologica espressione della singola funzione genica ma piuttosto l’insieme dei biomarcatori facenti parte di un unico pathway consentendo quindi una classificazione molecolare del tumore che, in associazione alle caratteristiche anatomo-patologiche, possa discriminare meglio i sottogruppi di pazienti. (Diapo 23 24). Tra questi nuovi strumenti d’analisi vanno ricordate l’analisi con i microarray che consente l’identificazione dei profili di espressione genica e la spettrometria di massa che consente invece la definizione del profilo proteico del tumore (diapo 25; diapo 26 con esempio di array e di proteine). Ed è proprio sfruttando questi nuovi approcci che nel 2002 è stato pubblicato il primo lavoro (diapo 27) nel quale si descrive per la prima volta la definizione di un profilo genico associato al rischio di ripresa nel tumore della mammella e in grado di discriminare le pazienti a cattiva prognosi sia all’interno del gruppo con linfonodi positivi che di quello senza linfonodi metastatici (diapo 27 28 29 30). Negli ultimi due anni molta strada è stata fatta e oltre ad essere stato identificato il panel di 72 geni in grado di definire questo profilo genico è stato possibile delineare il profilo genico associato alla progressione di malattia (diapo 31 32 33) indicando sempre più chiaramente che la strada da percorrere è quella che prevede l’integrazione delle informazioni derivanti dai profili di espressione genica e dagli studi di funzionalità proteica allo scopo di migliorare la definizione della biologia del tumore e identificare nuovi bersagli terapeutici (diapo 34).

Prognostic & predictive biomarkers: General concepts Novel technologies Genomics (Proteomics) 3. Application in breast cancer

Limitless replicative Human cancer: a series of genetic and epigenetic alterations that can be classified into 6 main classes and are responsable of the characteristics of the neoplastic phenotype Self-sufficiency in growth signals Limitless replicative potential Tissue invasion & metastasis Sustained angiogenesis Evasion of apoptosis Insensitivity to anti-growth signals

Biomarkers are important tools for cancer management These genetic and/or functional alterations may play an important role as tumor “biomarkers” Biomarkers are important tools for cancer management Monitoring patients with established disease for - Recurrence/Prognosis assessment - Prediction of response to drugs Early detection of asymptomatic patients - Aiding in the diagnosis - Surveillance of individuals known to be at risk of cancer - Surrogate endpoint markers for primary prevention strategies (i.e. chemoprevention)

The ideal tumor biomarker It must give clinically useful information for: The recognition of subgroups of pts who differ in disease outcome The identification of pts: at minimal risk of disease recurrence; at elevated risk, who may benefit from systemic treatment; more likely to respond to specific treatment

Predictive NOT prognostic (bax and chemotherapy) BIOMARKER Prognostic NOT predictive (lymphnode status) Predictive NOT prognostic (bax and chemotherapy) pos Survival (%) neg treatment control neg Survival (%) pos treatment control Separates poor from favorable groups independent of therapy Outcome in the absence of therapy is the same regardless the marker is + or - Adapted from Hayes et al., BCRT 52, 1998

Prognostic AND Predictive low high Survival (%) treatment control 20 40 60 80 100 TLI and CMF-based CT neg pos Survival (%) treatment control ER and hormone therapy Separates groups to some extent but much more in the presence of specific treatment Adapted from Hayes et al., BCRT 52, 1998

Three categories of prognostic factors strong moderate weak High risk Disease recurrence (%) medium risk Low risk adapted from Hayes et al., BCRT 52, 1998

PROGNOSTIC factors in breast cancer College of American Pathologists Consensus Statement 1999, Arch Pathol Lab Med, 2000 I Prognostic relevance Clinical stage (T,N,M) & proven clinical usefulness histologic grade mitotic index, histotype, steroid hormone receptorsu (uPA & PAI-1) II Many studies Proliferation indices biological & clinical, Peritumoral invasion but need of HER-2 /neu, p53 statistical evaluation III Prognostic relevance ploidy, neo-angiogenesis but not proven clinical apoptosis (bcl-2), usefulness based on GF and their Rec, available information pS2, Cathepsin D

Incidence of distant metastases 1800 patients with N- breast cancer undergoing loco-regional treatment only Incidence of distant metastases Estrogen Receptors Progesterone Receptors Follow-up (years) Silvestrini et al., JCO 1995; CCR 1997

Silvestrini et al., J Clin Oncol 1995; CCR 1997 Cell Proliferation (TLI) Incidence of distant metastases (1800 N-) Response to treatment (281 N- TLI >3%) CMF None 1 DISEASE FREE SURVIVAL 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0 1 2 3 4 5 6 7 8 YEARS HR=0.59 p=0.028 Follow-up (years) Silvestrini et al., J Clin Oncol 1995; CCR 1997 Amadori et al., J Clin Oncol 18, 2000

(212 N+/ER+ pts treated with Tamoxifen) Angiogenesis (Intratumoral VEGF) Disease recurrence (226 N- pts, surgery only) Response to treatment (212 N+/ER+ pts treated with Tamoxifen) VEGF- VEGF- VEGF+ VEGF+ HR=2.46 (1.29-4.65), P=0.0059 Coradini et al., Br J Cancer 2001 Coradini et al., Br J Cancer 2003

Prognostic relevance of uPA and PAI-1 4676 patients - Incidence of distant metastases Look et al. JNCI, 2002

A comprehensive view that helps: The score: A comprehensive view that helps: To identify patients: at low risk of disease recurrence who do not need adjuvant treatment at high risk of disease recurrence who may benefit from adjuvant systemic treatment

Tumor Size (cm) x 0.2 = points NOTTINGHAM PROGNOSTIC INDEX (NPI)   Tumor Size (cm) x 0.2 = points Tumor Grade*: from 1 (better) to 3 (worse) = points Axillary Lymph Nodes: negative nodes = 1 point; positive nodes, 1 to 3 positive = 2 points; positive nodes, >4 = 3 points *by whatever system Size + grade + lymph-node = Total NPI points Groups 80% OS @ 15 yrs if NPI <3.4 sum 42% OS @ 15 yrs if NPI 3.4-5.4 sum 13% OS @ 15 yrs if NPI >5.4 sum Conclusions: as to need for adjuvant CT need is doubtful MAY BENEFIT with CT chemo needed

Six-year recurrence rate as a function of bio-pathological score

The innovation Molecular signature of cancer Novel analytical tools From a “reductionistic” approach (gene by gene) to an “olistic” approach (global genomic analysis) Novel analytical tools Microarray technology Proteomics ……. Molecular signature of cancer

Genomica Proteomica Farmacogenomica Ricerca Clinica Prevenzione Catenine istologiche Diagnostica Proteomica

Novel analytical tools Genomics Novel analytical tools Gene Sequencing Conventional Karyotyping FISH (Fluorescent in Situ Hybridization) CISH (Chromogenic in Situ Hybridization) CGH (Comparative Genomic Hybridization) SKY (Spectral Karyotyping) Real Time RT-PCR cDNA Microarrays Catenine istologiche

Proteomics 2D-PAGE MS (Mass Spectrometry) HPLC (High Performance Liquid Chromatography) CA (Capillary Array) MALDI (Matrix Associated Laser Desorption/Ionisation) MALDI-TOF – MS (Time of Flight) MALDI – ION TRAP- TOF – MS ESI (Electron Spray Ionisation) Tandem – MS Quadrupole Functional proteomics TWO YEAST– HYBRID SYSTEM PROTEIN MICROARRAY FRET (Fluorescence Resonance) SELDI (Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionisation) TISSUE MICROARRAY Proteomics Catenine istologiche

Multispot Arrays Gene chip, DNA chip, DNA array, Protein chip….. Sonde: antigeni anticorpi cDNA oligonucleotidi prodotti di PCR plasmidi BACs (Bacterial Artificial Chromos.) YACs (Yeast Artificial Chromos.) Sonde (DNA, oligonucleotidi, proteine, anticorpi) Deposito blotting printing elettrodipendente Sintesi in situ meccanica fotolitografica elettrodi printing di precisione deposito sulla superficie tensione-dipendente Deposito o sintesi Substrato: vetro nitrocellulosa nylon vetro rivestito di poliacrilammide polipropilene silicone polistirene Spots sulla superficie di un substrato solido Gene chip, DNA chip, DNA array, Protein chip…..

MICROARRAYS a cDNA o OLIGONUCLEOTIDI Sistemi utilizzati per confrontare i livelli di espressione genica in due campioni diversi. Estrazione RNA cellulare Trasformazione in cDNA Marcatura del cDNA Ibridazione (DNA/nucleotidi) Lettura laser Analisi dati De Risi et al Science 278:680 (1997) Heller et al PNAS 94:2150 (1997)

Milioni di catene di DNA in ciascuno spot Un microarray è costituito da una superficie sulla quale sono depositate migliaia di sequenze specifiche di nucleotidi, ciascuna delle quali identifica un particolare gene. Le diverse migliaia di cDNA sono poste in spot separati. Ciascuno spot rappresenta un gene, in quanto contiene numerose copie di un cDNA corrispondente a tale gene. 1.28 cm 1.28 cm Milioni di catene di DNA in ciascuno spot 500.000 spot 25 basi in ogni catena GeneChip array

Plot multidimensionale RNA normale RNA del tumore Ibridando tale superficie con cDNA ottenuti dalla retro-trascrizione dell’RNA estratto da due campioni diversi è possibile determinare il livello di espressione dei singoli geni per confronto diretto tra l’abbondanza relativa di RNA prodotto. cDNA normale cDNA del tumore Ibridazione Analisi statistica Plot multidimensionale

Per effettuare tale confronto, i cDNA corrispondenti ai due differenti campioni vengono marcati con sostanze fluorescenti diverse e, ad ibridazione avvenuta, il microarray viene esposto ad una sorgente di luce laser. Gli spettri di emissione vengono quindi raccolti da uno scanner e le immagini monocromatiche indicanti i livelli diversi di espressione genica vengono pseudocolorate da un software di acquisizione d’immagine. De Risi J.L. et al Science 1997; 278:680-686. Heller R.A. et al PNAS 1997; 94:2150-2155.

Utilizzo dei microarrays Fattori Prognostici e predittivi Markers Diagnostici Targets per farmaci Attività farmaci Per lo studio di: Tumori Patologie su base genetica Malattie infettive ……

I cDNA MICROARRAYS nel 2004 Tre ditte stanno lanciando dei chip per l’intero genoma umano: Applied Biosystems, 30.000 geni tecnologia chemiluminescenza NimbleGenSystems, 190.540 probes con una media di 5 pobes per gene tecnologia fotolitografica Agilent Technologies, 44000 probes per 36.000 geni e trascritti tecnologia injk-jet Agilent's microarray, con 36.000 geni e transcritti su un singolo vetrino 1 x 3". I probes sono sintetizzati in situ usando la tecnologia ink-jet

Limiti dei Microarrays Disponibilità di tessuto “fresco” Esame dell’espressione genica limitato alla valutazione della presenza di mRNA Riproducibilità dei dati Eterogeneità delle cellule presenti nel campione

Laser capture microdissection (LCM) Campione eterogeneo Campione A Campione B Microdissezione Microdissezione Popolazione omogenea Popolazione omogenea Popolazione eterogenea Popolazione eterogenea

ANALISI PROTEOMICA Siero Proteine Peptidi Possibilità di individuare markers molecolari di tumori (o altre patologie) Frazionamento Digestione con enzimi proteolitici Cromatografia o 2D-PAGE Analisi con algoritmi specifici Spettrometria di massa Sidransky D. Emerging molecular markers of cancer. Nature Cancer Rev 2002; 2:210-9.

PROTEIN MICROARRAYS (ProteinChip) Sono utilizzati per esaminare: i livelli di espressione delle proteine le interazioni proteina-proteina le interazioni proteina-piccole molecole (farmaci, etc) le attività enzimatiche Page, M. J. et al. Proteomic definition of normal human luminal and myoepithelial breast cells purified from reduction mammoplasties. PNAS 1999; 96:12589–12594.

PROTEIN MICROARRAYS Esistono due tipi principali di chip: antibody arrays Ab Microarray 500™ - BD Biosciences' Clontech division, Palo Alto, CA > 500 anticorpi per quantificare proteine in lisati cellulari o altri campioni biologici TranSignal Human Cytokine Antibody Array 2.0 (Redwood City, CA) > 21 anticorpi per misurare citochine general protein arrays Yeast ProtoArray™ from Protometrix, Branford, CT, con circa 5.000 polipeptidi da Saccharomyces cervisiae per monitorare le interazioni proteina-proteina e proteina-piccole molecole (farmaci….) Yeast ProtoArray™

PROTEIN MICROARRAYS Individuazione nuovi biomarkers Siero Proteine Bio-chip Individuazione nuovi biomarkers SELDI-TOF MS m/z Pattern proteico Riconoscimento del pattern Conrads TM et al. Cancer diagnosis using proteomic patterns. Expert Rev Mol Diagn 3:411-20 (2003)

Nuovi Biomarkers individuati con il ProteinChip e tecnologia SELDI-TOF-MS Tumore kDa Nome Autore Pancreas 16.57 HIP/PAP-1 Rosty et al. Cancer Res 2002; 62:1868-1875 Vescica 3.4 Alpha-Defensina Vlahou et al. Am J. Pathol 2002; 158:1491-1501 Nasofaringe 11.6 11.8 Serum Amyloid A (SAA) isoform Yip et al - AACR 2002 Prostata 100 PSMA Wang et al. Int J. Cancer 2002; 92:871-876 Ovaio 9.2 79 54 Frammento di Aptoglobina Transferrina Catena pesante Ig Ye et al. Poster 3687 - AACR 2002 Rai et al. Arch. Pathol. Lab. Med 2002; 126:1518-1526 “ “ “

Gene profiling of breast cancer

Sorlie et al., PNAS 98, 10869-10874, 2001

Hierarchical clustering of 78 primary breast cancers and 4 normal breast tissue Dendrogramma “Alberi di unione tra i vari casi che si assomigliano” (i.e: intensità di colore relativo ad un gene o a gruppi di geni) 5 differenti fenotipi

Cluster analysis ER- ER+ Sorlie et al., PNAS, 98, 2001

Van ‘t Veer et al. Nature 415, 530, January 2002

78 sporadic BC (T<5cm, N-) + 20 BRCA1/2+ BC 78 sporadic BC (T<5cm, N-) 34 pts w metastases <5 y 44 pts NED >5 y 25,000 genes of microarray Unsupervised hierarchical clustering ~5000 genes significantly regulated (in > 3 tumors) Supervised hierarchical classification 231 genes correlated w disease outcome Rank-ordered based on p-value 70 genes = Poor/Good prognostic signature correctly predicted disease outcome in 65/78 sporadic tumors

Tumori clinici: studio pilota Good prognosis signature Tumori clinici: studio pilota Poor prognosis signature Tumori clinici: serie di validazione (N=19) Van’t Veer et al., Nature 415, 2002

295 carcinomi mammari sporadici T<5 cm, N-/N+ < 53 anni: Decorso clinico in base al profilo di espressione genica (70-gene prognosis signature) Van de Vijver et al., NEJM, 347, 25, 2002

295 sporadic breast cancers: Clinical course according to gene expression profile Van de Vijver et al., N Engl J Med, 2002

151 N- patients Van de Vijver et al., N Engl J Med, 2002

144 N+ patients Van de Vijver et al., N Engl J Med, 2002

151 N- patients: Clinical course according to molecular signature (A) or clinico-patological classification (B, C) Van de Vijver et al., N Engl J Med, 2002

Therapeutic benefit According to usual selection criteria (EBCTCG) over 100 pts N- pre-menopausal pts receiving adjuvant chemotherapy, 83.5 are alive even without chemotherapy and 13.5 die despite chemotherapy at 5 years FU. Using gene expression profile, only 22.5% of pts will be over-treated

Clin Cancer Res 10: 2272-83, 2004

Clin Cancer Res 9: 6326-34, 2003

PE, Ab to CK & HER-2 FISH BM, Ab to CK BM, Ab to CK & nuclear Counterstaining w d-p-indole Same as in C Ab to uPAI-R

AdnaGen CancerSelect Test system for the early detection of Genzyme Virotech GmbH Test system for the early detection of disseminated cells in blood for a better diagnostic and monitoring of colon and breast cancer patients

Will the new molecular knowledge be applied to “bedside”?

EORTC/TRANSBIG MINDACT TRIAL The first large-scale independent trial to prospectively validate the 70-gene expression signature (MammaPrint®) in breast cancer. Adequate Processed Core Biopsy Prognostic Risk Evaluation Randomize Clinico-pathological Microarray Low Risk Low Risk Average/High Risk Chemotherapy Possible further randomization Endocrine therapy Possible further randomization MammaPrint® has reached level 3 in Evidence Based Medicine

Other ongoing trials incorporating translational research in BC Evaluating predictive factors for response: BIG p53 (EORTC 10994): pts with LABC Tax vs Non-Tax CT (Neoadjuvant) Evaluating prognostic factors (uPA/PAI-1) EORTC-RBG: High-Risk, Node-negative (NNBC-3) FEC vs FEC Docetaxel ADEBAR:  4+ lymph nodes Adjuvant Epirubicin Docetaxel (Wilex's uPA inhibitor WX-UK1)

Setting The Gene Expression Base-Line For Breast Cancer Research Date: May 05, 2004 Affymetrix Launches ENCODE Array to Uncover Hidden Function of Human Genome October 22, 2004 Toray Develops Ultra Sensitive, Quick DNA Chip Date : September 20, 2004 Agilent Partners with TGen to Develop CGH Arrays for Cancer Research June 8 SIRS-Lab releases new biochip Date: September 22nd, 2004 Velcura to use custom Affymetrix technology August 03, 2004 Affymetrix and Immusol to Collaborate on Cancer Drug Discovery June 22, 2004 Predicting cancer patient survival with gene- expression data Date: May 06, 2004 Agilent Acquire Silicon Genetics August 29, 2004 BioTrove Announces OpenArray™ Transcription Analysis System Date: September 20, 2004 Illumina Announces 100,000 SNPs on a Single BeadChip Date: April 21, 2004 Toshiba to Develop DNA Chip with Osaka University July 20, 2004 NCI awards grant for gene expression research DATE: Thursday, April 15, 2004 Gene Logic Provides Data from GeneExpress System to FDA May 13, 2004 Expression Analysis Launches Affymetrix Microarray-Based Genotyping Services Date: September 14, 2004

Can the novel technologies be used to predict the therapeutic response?

Nature Clin Pract Oncol 1; 44-50, 2004

Early BC New Engl J. Med. 351: 2817-2826 (2004)

Oncotype DX from Genomic Health Panel of the 21 genes and the Recurrence Score Algorithm Oncotype DX from Genomic Health

Advanced BC J. Clin. Oncol. 23: 732-740 (2005)

GENES & GENE PRODUCTS INVOLVED IN DRUG RESISTANCE/SENSITIVITY (Cancer literature) Anthracyclines Topoisomerase II, MDR, MRP, ErbB-2 5-FU, Capecitabine Cyclin D1, Thymidilate synthase, Thymidine phosphorylase, NFkB, p53, Bax/Bcl2 Gemcitabine Ribonucleotide reductase, 5-nucleotidase, b-tubilin III deoxycytidine-kinase Vinca Alkaloids MAP4, Topoisomerase I Taxol b-tubulin III, MDR, MAP4, survivin Platin compounds ERCC1, MDR1, b-tubulin III, XPA, XPD, cJun XPG, p53, cyclinD1, GSTpi, MLH1, MSH6 Irinotecan, Topotecan Topoisomerase I, p14ARF, carboxylesterase, MDR Small TRK inhibitors Akt, MAPK, ecc

“Smart Chip” (antibody array)       “Smart Chip” (antibody array) A CINBO’s Project   1. Topo II MDR1 ErbB-2 1. Anthracyclines 2. TS Cyclin D1 Bcl-2/bax   2. Fluoropyrimidines 3. Topo I p14ARF 3. Taxanes Breast cancer Colorectal cancer   1. Topo I p14ARF Irinotecan 2.   TS Cyclin D1 Bcl-2/bax 2. 5-FU, capecitabine   3. ERCC1 p53 cJun 3. Platin compounds

+ “Smart Chip” (antibody array) FFIA (Fluorescent Immuno Assay) A CINBO’s Project FFIA (Fluorescent Immuno Assay) 2. Rh-Fusion-GFP proteins 1. Biopsia del paziente (Biomarkers) Fluorescence intensity + Amount of Biomarker Biotin-Antibody coated chip

Conclusion The emerging fields of genomics (and proteomics) offer the ability to precisely analyze the molecular portrait of a particular patient’ tumor; These approaches appear extremely useful for defining individual patient’s prognosis and assessing responiveness to anti-cancer therapy; A new era will come soon, wherein we will treat each patient with a “prescription” based on the molecular profile of its tumor resulting in more rationale use of the therapy

Good prognostic signature White = ED pts Black = NED pts Poor prognostic signature