Identificare le proteine che sono in grado di interagire con il prodotto del gene di interesse in modo specifico: Co-immunoprecipitazione Libreria con il “sistema doppio ibrido di lievito” -Interaction trap system (Fields and Sternglanz 1994): le proteine che si legano fisicamente l’una all’altra vengono Individuate mediante la loro capacita` di attivare la trascrizione di un gene indicatore Il sistema a singolo ibrido. Obiettivo identificare le proteine che si legano ad un elemento di regolazione bersaglio, che agisce in cis, solitamente una sequenza di DNA Sistema a triplo ibrido: terza molecola che puo`essere un RNA o una molecola proteica

I sistemi “a doppio Ibrido” e a “singolo ibrido” in lievito A) Il sistema “a doppio ibrido” in lievito. Il gene indicatore integrato nel genoma di lievito verrà espresso solo se è disponibile un adatto fattore di trascrizione. Ciò accade quando vengono messe a contatto due proteine di fusione: una contenente un dominio per il legame al DNA (BD) e l’altra contenente un dominio di attivazione (AD). La proteina bersaglio X è fusa con il dominio di legame che riconosce le sequenze attivatrici a monte (promotore) adiacenti al gene indicatore. La libreria del domino di attivazione rappresentata in altro a destra può esprimere proteine di fusione contenenti un dominio di attivazione associato a una delle molte proteine non caratterizzate (1,2,3,4,). B) il sistema “ a singoolo ibrido” in lieviot

Phage Display Inserimento di frammenti di DNA estraneo nel gene di una proteina fagica di rivestimento. Il gene modificato e`espresso come proteina di fusione, che viene incorporata nel virione e risulta visibile sulla superficie del fago. Tra le applicazioni: -ingegneria degli anticorpi -ingegneria dell proteine in generale (es. selezione di varianti desiderabili da una libreria di mutanti) -studio delle interazioni proteina-proteina

Phage display Il phage display è una forma di clonaggio di espressione che comporta il clonaggio di un cDNA in vettori fagici e l’espressione di proteine estranee sulla superficie dei fagi.

Manipolazione genetica degli animali -Studio della funzione genica -Modelli animali per le malattie Oocita fecondato Cellule staminali embrionali (ES, post-zigotiche nessuna separazione fra linea somatica e linea germinale)

Preparazione di topi transgenici mediante microiniezione nei pronuclei Il transgene è presente in tutte le cellule nucleate. In seguito all’integrazione cromosomica, I transgeni possono essere trasmessi alle generazioni successive secondo modalità mendeliane: se il DNA estraneo si è integrato nello zigote verrà trasmesso al 50% della progenie

Le cellule ES modificate geneticamente costituiscono un mezzo per trasferire DNA estraneo o mutazioni specifiche nella linea germinale del topo Le cellule ES modificate geneticamente costituiscono un mezzo per trasferire DNA estraneo o mutazioni specifiche nella linea germinale del topo

La mutagenesi mirata mediante ricombinazione omologa può Vettori di inserzione La mutagenesi mirata mediante ricombinazione omologa può inattivare un predeterminato gene cromosomico all’interno di una cellula integra “Hit and run” Il metodo del vettore a integrazione. Il DNA vettoriale introdotto (blu) viene tagliato in un unico punto all’interno di una sequenza identica o molto simile a parte di un gene cromosomico (nero). Può succedere che si verifichi ricombinazione omologa (X), portando all’integrazione dell’intera sequenza vettoriale, compreso il gene marcatore (M). Si noti che le lettere non rappresentano degli esoni, ma vogliono semplicemente indicare l’ordine lineare all’interno del gene. B) il metodo del vettore di sostituzione. In questo caso, il gene marcatore è contenuto all’interno della sequenza omologa del gene endogeno e il vettore viene tagliao in un unico punto esterno alla sequenzq omologa. Una doppia ricombinazione o un evento di conversione genica (XX) possono dar luogo alla sostituzione di sequenze interne del gene cromosomico con sequenze omologhe del vettore, compreso il gene marcatore.

La mutagenesi mirata con doppia sostituzione può essere usata per introdurre nel DNA piccole mutazioni TK esterno alla regione di omologia HPRT+ TK- Per introdurre una piccola mutazione senza lasciare sequenze esogene residue, si può utilizzare un metodo a doppia sostituzione con una selezione positiva e negativa. Gli esoni nel gene endogeno sono rappresentati come quadrati numerati, gli introni invece come rettangoli più sottili. Per poter introdurre una piccola mutazione si usa la “conversione genica”. Topi sottoposti a questi riarrangiamenti non possono essere definiti transgenici a causa della mancanza di sequenze estranee nella linea germinale. HPRT- “Tag and exchange” Vettori di sostituzione

Il metodo knock-in consente di sostituire l’attività di un gene di un P promotore, e il sito di poliadenilazione (pA). Il vettore utilizzato per la mutagenesi mirata (knock-in vector) contiene le sequenze clonate del gene En-1, Il metodo knock-in consente di sostituire l’attività di un gene di un dato cromosoma con quella di un altro gene appositamente introdotto Il gene En-2 va a finire sotto il controllo del promotore di En-1

Sistemi di ricombinazione sito-specifica CRE-loxP del batteriofago P1 CRE Causa di recombinazione media la ricombinazione fra due sequenze loxP con lo stesso orientamento, in seguito a tale evento la sequenza collocata fra I due siti viene escissa

Struttura della sequenza di riconoscimento di loxP Si noti che la sequenza centrale di 8 nucleotidi, fiancheggiata dalle unità ripetute di 13 nucleotidi, è asimmetrica e conferisce un orientamento. loxP loxP

Gene trapping Il “gene trapping” utilizza un transgene incapace di essere espresso per selezionare favorevolmente gli eventi di integrazione cromosomica che si verificano dentro o vicino a un gene Principio: gene indicatore è espresso solo dopo il suo inserimento in un gene (sia introne che in un esone) o in un promotore. Integrandosi puo’ acquisire gli elementi che mancano per essere espresso

Clonazione animale La pecora Dolly è il frutto del primo tentativo riuscito di clonazione animale (1997).

Anthony J. F. GRIFFITHS et al. GENETICA sesta edizione Cap 11 Isolamento e Manipolazione del gene

Metodi con cui si puo’ introdurre in una cellula DNA estraneo Trasformazione 2) Bombardamento 3) Iniezione 4) Infezione tramite virus

Quattro tipi di plasmidi usati nel lievito

Due metodi con cui un ceppo ricevente di lievito puo’ essere trasformato

Ingegneria genetica delle piante Plasmide Ti

200kb T-DNA viene trasferito nelle cellule ospiti in posizioni casuali

Passaggi per ottenere vettori adatti a generare piante transgeniche: Disarmare il vettore Costruzione vettore intermedio con gene di interesse Ricombinazione del vettore intermedio con il Ti disarmato

Il T-DNA insieme a qualsiasi segmento di DNA in esso contenuto -si e’ inserito in un cromosoma della pianta transgenica, quindi Viene ereditato come un carattere mendeliano semplice

Ingegneria genetica degli animali BIOREATTORI

Gene targeting Knockout

Produzione di un topo knockout

Terapia genica Ormone della crescita di ratto (RGH) posto sotto il controllo di un promotore di topo che risponde ai metalli pesanti, viene inserito in un plasmide e usato per produrre un topo transgenico. L’ormone prodotto compensa il nanismo innato del topo (lit/lit). Nelle generazioni successive, RGH viene ereditato come un carattere mendeliano dominante, come appare dall’albero genealogico qui riportato

Terapia genica germinale non e’ mai stata sperimentata su essere umani Terapia genica somatica; correzione di fenotipi patologici causati da geni espressi in misura predominante in un solo tessuto