Quantificazione del DNA estratto e determinazione del sesso genetico Modulo di Genetica Forense Quantificazione del DNA estratto e determinazione del sesso genetico Magg inv sc Giuseppe IACOVACCI

Importanza della quantificazione Input di DNA “ottimale”

Eccesso di DNA in amplificazione Difetto di adenilazione Pull up Aumento del rumore di fondo Pull up

Difetto di DNA in amplificazione In queste condizioni l’analisi risulta affetta da problemi stocastici (che possiamo ovviare se aumentiamo il DNA in PCR) Se invece è un problema legato alla scarsa disponibilità di templato dobbiamo interpretare il dato con un approccio LCN

Normalizzazione Effettuabile con un liquid handler in automatico sulla base della quantificazione a meno di misture

Quantificazione del DNA estratto DOT-BLOT ELETTROFORESI GEL AGAROSIO LA SPETTROFOTOMETRIA “UV” LA FLUORIMETRIA

Plexor® HY Amplification Targets 4-color, triplex Plexor® qPCR assay Autosomal – fluorescein 99bp multicopy target (RNU2) on chromosome 17 repeated motif ~6kb Locus is conserved in primates Y – Cal Orange 560 133bp multicopy target (TSPY/DYZ5) on short arm repeat motif ~20kb IPC – Cal Red 610 150bp, novel target Normalizzatore di fluorescenza Multicopy targets Increased sensitivity and reduced impact of primer site mutation Autosomal and Y have similar copy number

The 4NS1C target is a multi-copy target which was validated in an external study. It is represented by about 20 copies per haploid genome and is located on different autosomal chromosomes. This quality sensor is designed to be less stable than the 4NS1C target, showing a shift (mostly not a complete failure) of the CT value in the presence of inhibitors.

Il mio parere Perché utilizzare la PCR quantitativa??? Visto che le nostre analisi son end-point! E se sviluppassimo un sistema a due colori (cromaticamente adiacenti) con ampliconi da 100 a 600 bp (possiamo alloggiare 7-9 marcatori STR) che coamplifica un target sensibile agli inibitori come IPC (o magari due uno per i bassi pesi molecolari e uno per alti pesi molecolari per vedere la tenuta dell’enzima) su un terzo colore Avremo un sistema di screening da poter utilizzare per normalizzare prima del megaplex che gira sul sequenziatore (ma forse qualcuno deve vendere le real-time!!!!?)

Determinazione del sesso genetico sulle tracce AmpFLP Y specifici RFLP con sonde Y specifiche

Il sistema amelogenina Locus per la determinazione genetica del sesso La determinazione del sesso di pertinenza del materiale genetico estratto è stata condotta mediante lo studio del dimorfismo sessuale associato al locus per il gene della Amelogenina (Sullivan KM et al 1993). Questo gene codifica per la principale proteina della matrice extracellulare implicata nell’osteogenesi della gemma dentale. Questo locus è presente tanto sul cromosoma X in posizione p22.1-22.3 che sul cromosoma Y in posizione p11.2 (quello sull’Y è uno pseudogene) e l’amplificato ottenuto dai due cromosomi presenta una differenza di lunghezza, in particolare il frammento prodotto dal cromosoma X è lungo 213 bp mentre quello del cromosoma Y è lungo 219 bp. (i primer originali producevano ampliconi di 106-112) Ma in alcuni mammiferi dentati questi stessi primer producevano un frammento specifico di 103 bp

Il sistema amelogenina

Il sistema amelogenina Power plex 16HS Identifiler NGM ESX 17

Il sistema amelogenina Le regole in biologia ammettono eccezioni

Ma comunque una volta che conosciamo l’eccezione! Promega PowerPlex Fusion®

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