ENZIMI DI RESTRIZIONE

Reazione ligasica di frammenti di restrizione

CLONAGGIO DNA RICOMBINANTE: DUE MOLECOLE DI DNA VENGONO UNITE IN PROVETTA SFRUTTANDO LE PROPRIETA’ DI ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II E DELLA DNA LIGASI CLONAGGIO -IN BIOLOGIA CLONARE UN ORGANISMO SIGNIFICA OTTENERE UN INDIVIDUO UNA POPOLAZIONE DI ORGANISMI CHE SONO GENETICAMENTE IDENTICI -IN BIOLOGIA MOLECOLARE CLONARE UN TRATTO DI DNA SIGNIFICA OTTENERE UNA POPOLAZIONE DI DNA IDENTICHE ALLA MOLECOLA DI PARTENZA

Vettori e clonaggio Vettori Plasmidi Fagi Cosmidi YAC

Molecola circolare di DNA a doppio filamento, normalmente presente Vettori e clonaggio Plasmide Molecola circolare di DNA a doppio filamento, normalmente presente nella cellula batterica, in grado di replicarsi autonomamente dal cromosoma.

VETTORI DI CLONAGGIO

Bromo-chloro-indoyl--galactopyranosidase or X-Gal (Clear) -galactosidase Bromo-chloro-indoyl (Deep blue insoluble) + galactose

Bacteria from ligation plated on ampicillin and X-Gal Contains wild type plasmd Contains recombinant plasmd

DNA clonabile in un plasmide: Vettori e clonaggio Lunghezza massima del DNA clonabile in un plasmide: circa 20 Kb

I virus sono piccoli parassiti non in grado di replicarsi. Vettori e clonaggio I virus sono piccoli parassiti non in grado di replicarsi. Dopo aver infettato una cellula-ospite utilizzano i suoi sistemi di replicazione e sintesi delle proteine per riprodursi

I batteriofagi (o fagi) sono virus che infettano i batteri. Vettori e clonaggio I batteriofagi (o fagi) sono virus che infettano i batteri.

Il fago più utilizzato in biologia Vettori e clonaggio Il fago più utilizzato in biologia molecolare è il fago 

Vettori e clonaggio Assemblaggio di un fago 

Mappa del genoma del fago  Vettori e clonaggio Mappa del genoma del fago 

Vettori e clonaggio Clonaggio di frammenti di DNA nel fago 

Formazione di cloni fagici Vettori e clonaggio Formazione di cloni fagici

L’infezione dei batteri con il fago  è circa 103 volte più efficiente Vettori e clonaggio L’infezione dei batteri con il fago  è circa 103 volte più efficiente della trasformazione con un plasmide

Lunghezza del DNA clonabile in un fago: 20-25 Kb Vettori e clonaggio Lunghezza del DNA clonabile in un fago: 20-25 Kb

Un cosmide è un plasmide contenente la sequenza COS Vettori e clonaggio Un cosmide è un plasmide contenente la sequenza COS dal fago 

Vettori e clonaggio

Vettori e clonaggio Clonaggio di frammenti di DNA in un cosmide

clonabile in un cosmide: Vettori e clonaggio Lunghezza del DNA clonabile in un cosmide: circa 45 Kb

EcoR I Genomic Library Infect cells

AAAAAA cDNA synthesis cDNA library Infect cells

Genomic Library Construction Preparing the insert Partial digestion preferred

Genomic library cDNA library Source Variation Insert size Genomic DNA mRNA Source Species or strains Tissues Developmental stages Variation 12k -- 20k 0.2k -- 6k Insert size Equal Correlate with expression level Representation Only one Expression vs. non expression Type DNA DNA or antibody or protein Probe Gene structure Infer protein identity Encoded protein Purpose

Screening with DNA probe Probe is identified cloned From other organism Same organism Looking for variants Chromosome walk Chromosome walk

Genome Projects Whole genome sequencing Fragment and clone Sequence ALL clones! Computer assembles

   Bee             Cat             Chicken             Cow             Dog             Fruit fly    Human    Malaria parasite    Microbial Genomes    Mosquito     Mouse    Nematode    Pig              Plant Genomes Central    Rat    Retroviruses     Sea urchin Tribolium            Sheep             Zebrafish Genome Projects Multiple organisms provide suitable systems for experimentation Zebrafish-development Rat-physiology Dog- genetic disease Fruit fly- behavior Some of practical significance Mosquito/Malaria parasite

(o metodo a terminazione di catena) Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena) Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad 1) Uno stampo a singola elica 2) un innesco specifico (primer) 3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35S ha bisogno di: 4) una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza

Terminazione della catena La sintesi del filamento compementare, tuttavia non prosegue indefinitivamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossinucleotidi trifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento perché posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’

Schema di sequenziamento a terminazione di catena DNA stampo a singola elica 3’-GGCTAAC Ibridazione con Il primer 5’ 3’ 3’-GGCTAAC + [35S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP -CCG ddA -ddC -CC ddG -CCGA ddT -C ddC -CCGATT ddG -CCGAT ddT A C G T -CCGATT ddG -CCGAT ddT -CCGA ddT -CCG ddA -CC ddG -C ddC -ddC G T T A G C C Direzione di lettura Sequenza: 5’-CCGATTG

Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti Coniugando a ciascun ddNTP un diverso marcatore fluorescente, è possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggio e caricare il tutto in solo pozzetto di gel ddA ddT ddC ddG

Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e le informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.

Fluorescent DNA Sequencing A G T A C T G G G A T C Gel Electrophoresis

Detection of Fluorescently Tagged DNA DNA Fragments Separated by Electrophoresis Optical Detection System Scanning Laser Excites Fluorescent Dyes Output to Computer

Fluorescent DNA Sequencing Data

Fluorescent DNA Sequence Trace

Size of gene library N = ln(1-P) ln (1-A/B) N = Number of clones P = 95 % probability of finding gene A = Average size of DNA fragments B = Total size of genome E. coli has genome of 4,800,000 nucleotides Average size of insert is 10,000 nucleotides Number of clones for 95 % probability is 1700

Size of gene library If genome is large e.g. human genome (3 x 109) then number of clones to make library becomes unrealistic (1058000) if using a plasmid vector (accepts only 10 kb as larger DNA can’t be transformed) Therefore need to use vectors that can accept larger pieces of DNA I.e. if each vector contains a large piece of DNA you don’t need so many clones to make a gene library

What vectors for what libraries? Human library requires >1,000,000 plasmid clones Human library requires 14000 YAC clones

YAC=yeast artificial chromosome Vettori e clonaggio YAC=yeast artificial chromosome

Vettori e clonaggio

Lunghezza del DNA clonabile in uno YAC: fino a 1000 Kb Vettori e clonaggio Lunghezza del DNA clonabile in uno YAC: fino a 1000 Kb

Approximate Maximum Length of DNA That Can Be Cloned in Vectors Vettori e clonaggio Approximate Maximum Length of DNA That Can Be Cloned in Vectors Vector Type Cloned DNA (kb) Plasmid 20 λ phage 25 Cosmid 45 P1 phage 100 BAC (bacterial artificial chromosome) 300 YAC (yeast artificial chromosome) 1000

Whole Genome Shotgun Celera Genomics Fragment and sequence entire genome The entire genome is fragmented into small pieces, with no prior knowledge regarding the order or relationship of the clones to on another prior to sequencing. Assembly of these pieces is done by a computer, by searching for overlapping sequences. Each fragment is sequenced completely and then these pieces are aligned to one another by a computer, based on overlapping sequence between fragments.

Overview of Facts Asserted 2.91 billion base pairs (bp) 1.1% exons, 24% introns, 75% intergenic DNA 2.1 million single nucleotide polymorphisms (SNP’s) less than 1% of all SNP’s reflected changes in proteins

Structure of the genome

http://genome.ucsc.edu

http://www.ncbi.nlm.nih.gov