Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Altisonante Misterioso Inquietante

Nucleare

Prima portarono la CALAMITA.” “Tutti gli anni, verso il mese di marzo, una famiglia di zingari cenciosi piantava la tenda vicino al villaggio, e con grande frastuono di zufoli e tamburi faceva conoscere le nuove invenzioni. Prima portarono la CALAMITA.” Gabriel Garcia Marquez Cent’anni di solitudine Magnetica

Cronologia NMR 1945 Prima osservazione di un segnale NMR Bloch e coll. Stanford Un. (1H in H2O) Purcell e coll. Harvard Un. (1H in paraffina) (nobel 1952) 1950 Scoperta del Chemical Shift 1961 Primo spettrometro commerciale CW 1970 Primo spettrometro commerciale FT 1976 Primi esperimenti 2D ( Ernst 1991 Nobel) 1980 Spettrometri NMR di II generazione

L’origine fisica dell’NMR Pauli nel 1924 introdusse l’idea dello spin nucleare Protoni e neutroni possiedono un momento angolare di spin con relativo numero quantico di spin I=1/2 In nuclei diversi da 1H il numero quantico di spin può essere intero, semiintero o nullo; in particolare: numero di massa dispari spin semiintero numero di massa pari e n. atomico pari spin nullo numero di massa pari e n. atomico dispari spin intero L’NMR dipende dall’esistenza dello spin nucleare quindi nuclei con I=0 sono magneticamente inattivi.

L’energia classica di un momento magnetico μ in un campo magnetico B è E = - μ.B

Spin e abbondanza nucleare Isotopo Spin I % 1H 1/2 99.98 2H 1 0.016 12C 98.89 13C 1.11 14N 99.64 15N 0.36 16O 99.76 17O 5/2 0.037 31P 100

n=gHo DE=hn DE= g h Ho N-/N+=e-DE/kT Diagramma dell’energia Ho N- Livelli degeneri n=gHo

Condizione di risonanza hν = γ ħ B0 Differenza di energia tra i due livelli mI = +1/2 e mI=-1/2 di un nucleo con spin I = 1/2 in un campo magnetico B0 ΔE = Eα –Eβ = γ ħ B0 Condizione di risonanza hν = γ ħ B0 NMR risonanza magnetica nucleare B0 = 12 T ν = 500 MHz λ ≈ 60 cm

<< Le cose hanno vita propria >> proclamava lo zingaro con aspro accento, << si tratta solo di risvegliargli l’anima.>> 2I+1 orientazioni possibili

Irradiando il campione con delle opportune radiofrequenze e misurandone l’assorbimento potremmo ottenere lo “spettro” del composto in esame. 1H 13C 31P 15N MHz

Intensità del segnale cresce Spettrometro NMR Intensità del segnale  (Nα – Nβ)B0 L’eccesso di popolazione nello stato ad energia inferiore è dell’ordine di 10-6 Intensità del segnale cresce al crescere del campo magnetico B0 al crescere di γ 1H > 13C al diminuire di T

Lo spostamento chimico Se tutti i protoni assorbissero alla stessa frequenza in un campo magnetico esterno B0, l’informazione sarebbe praticamente nulla. Nucleo nel campo magnetico B0 Atomo nel campo magnetico B0 Ma il campo magnetico esterno B0 induce una circolazione di elettroni che crea un campo magnetico addizionale δB0 δB0 = -σ B0 σ costante di schermo I nuclei interagiscono con il campo magnetico locale.

Chemical shift Gli elettroni di un atomo inducono un piccolo campo magnetico che si oppone a quello principale Il campo magnetico sperimentato dal nucleo è generalmente minore del campo effettivo di un fattore s H = Ho (1- s) n = g H Nuclei dello stesso atomo assorbono a frequenze leggermente diverse a causa del loro “intorno chimico”

Il campo magnetico locale Bloc = B0 + δB0 La corrente indotta dal campo magnetico esterno B0 (e quindi il campo magnetico addizionale) dipende dai dettagli della struttura elettronica attorno al nucleo. Nuclei diversi in diversi gruppi chimici hanno diverse costanti di schermo.

A seconda dell’ambiente chimico, i protoni in una molecola sono schermati in quantità diverse Più schermati assorbono a campi più alti meno schermato assorbe a campi più bassi B0 →

La frequenza di Larmor è Al variare di B0 varia la frequenza di risonanza. Si introduce lo spostamento chimico Come frequenza di riferimento si conviene di utilizzare la frequenza del tetrametilsilano.

Tetrametilsilano TMS è aggiunto al campione. Poiché Si è meno elettronegativo di C, i protoni di TMS hanno schermo alto. Il loro segnale è definito come zero. I protoni delle molecole organiche assorbono a campi bassi (alla sinistra) del segnale TMS.

Scala delta Il valore dello spostamento chimico δ non dipende dalla potenza del magnete (dall’apparecchiatura utilizzata)

Diagramma di correlazione 1H NMR

Risonanza di diversi gruppi Gli spettri NMR sono riportati per valori di δ crescenti da destra verso sinistra. Originariamente gli spettri venivano ottenuti con una frequenza fissa e facendo crescere B0. Quindi i segnali di atomi molto deschermati comparivano a campi bassi e via via quelli a campi più alti (e quindi δ più piccolo). Lo spettro dell’etanolo può essere interpretato considerando la presenza dell’ossigeno. Sottrae carica all’H a cui è direttamente legato e che quindi è fortemente deschermato (δ ≈ 4), ha minore effetto sugli H del gruppo CH2 (δ ≈ 3.6), ha effetto trascurabile sugli H di CH3. L’integrazione del segnale (area sotto i picchi) dei 3 gruppi porta a valori 1:2:3 legato ai numeri di H dei tre gruppi. Spostamento chimico ed intensità dei segnali aiutano ad interpretare gli spettri NMR.

Posizione dei segnali Atomi più elettronegativi deschermano maggiormente e generano spostamenti chimici δ più grandi. Un maggior numero di atomi elettronegativi causa un aumento dello spostamento chimico δ. L’effetto decresce con la distanza. CH3X Cl Br I  3.0 2.7 2.1

Correnti d’anello Idrogeni legati ad anelli aromatici presentano valori di  elevati. La corrente di anello è indotta in un campo magnetico dagli elettroni π delocalizzati e genera un campo magnetico addizionale. Nel centro dell’anello il campo indotto è in direzione opposta al campo magnetico esterno. I protoni nel piano dell’anello sono deschermati, un sostituente sopra l’anello è schermato.

σ(solvente) Interazioni specifiche soluto-solvente (es. legame ad idrogeno) portano a effetti di schermo o di minor schermo in dipendenza della posizione relativa del soluto rispetto al solvente.

La struttura fine 1,2-dicloroetano 1,1-dicloroetano

“Molteplicità” dei segnali NMR Ad ogni protone (carbonio, azoto …) chimicamente diverso corrisponde un segnale di diversa frequenza. La “forma” del segnale in uno spettro NMR spesso non è un semplice picco di assorbimento ma può assumere aspetti molto diversi. Singoletto Doppietto 1:1 Tripletto 1:2:1 Quartetto 1:3:3:1 Quintetto 1:4:6:4:1

Tutte le possibilità esistono, pertanto il segnale è suddiviso. Protoni non equivalenti su atomi di C adiacenti hanno campi magnetici che possono allinearsi con il campo esterno od opporsi ad esso. Questo accoppiamento magnetico fa si che il protone assorba a campi leggermente più bassi quando il campo esterno è rinforzato e a campi leggermente più alti quando il campo esterno è opposto. Tutte le possibilità esistono, pertanto il segnale è suddiviso. L’interazione è espressa dalla costante di accoppiamento scalare J (Hz)

n = g H0 La molteplicità dei segnali è dovuta ai “vicini di casa” Ho + d HaHb | | -C—C- b Ho a b Ho - d n = g H0 Doppietto 1:1

Ho + d HaHb | | -C—C-Hc b c a Ho 2 Ho Ho - d Tripletto 1:2:1

Sistema AX2 La risonanza dell’atomo A è divisa in un doppietto di separazione J per interazione con un nucleo X e ciascuna linea è ulteriormente divisa in un doppietto di separazione J per interazione con un secondo nucleo X. Tre linee con rapporto di intensità 1:2:1 Il campo sperimentato da A è αα αβ βα ββ

Sistema AX3 La risonanza dell’atomo A è divisa in un doppietto di separazione J per interazione con il primo nucleo X, ciascuna linea è ulteriormente divisa in un doppietto di separazione J per interazione con il secondo nucleo X, ciascuna linea è ulteriormente divisa in un doppietto di separazione J per interazione con il terzo nucleo X. Quattro linee con rapporto di intensità 1:3:3:1 Il campo sperimentato da A è ααα ααβ αβα βαα αββ βαβ ββα βββ

L’interazione con nuclei con I = 1 porta a tre componenti di uguale intensità.

1,1,2-Tribromoetano Protoni non equivalenti su carboni adiacenti.

Doppietto: 1 Protone adiacente

Tripletto: 2 Protoni adiacenti

La regola N + 1 Se un segnale è diviso da N protoni equivalenti, è diviso in N + 1 picchi. =>

Estensione dell’accoppiamento magnetico Protoni equivalenti non si suddividono . Protoni legati allo stesso carbonio si suddividono solo se non sono equivalenti. Protoni su carboni adiacenti normalmente si accoppiano. Protoni separati da quattro o più legami non si accoppiano.

Costanti di accoppiamento J : distanze tra i picchi del multipletto. J misurate in Hz. Non dipendono dalla forza del campo esterno. NJ costante di accoppiamento tra due nuclei separati da N legami. 1JCH 13C-H 2JCH 13C-C-H

Le Risonanze Magnetiche NMR in soluzione (ad alta risoluzione) NMR allo stato solido (CP-MAS) NMR in vivo Risonanza magnetica ( imaging)

NMR in soluzione NMR dei chimici I composti vanno sciolti in un solvente deuterato Massima omogeneità del campo magnetico Spettri affilati poiché il rapido moto casuale delle molecole media a zero le interazioni dipolari anisotropiche

magnete a super- conduzione computer controlli elettronici magnete a super- conduzione

Solvente deuterato Tubo NMR

Risonanza magnetica imaging (MRI) la MRI e' una modalità di imaging usata principalmente per costruire immagini a partire dal segnale NMR proveniente dagli atomi di idrogeno presenti nell'oggetto esaminato. Nell'MRI medica, i radiologi sono per lo più interessati al segnale NMR proveniente da acqua e grasso, essendo questi i componenti del corpo umano che contengono le maggiori quantità di idrogeno. L’ energia coinvolta nelle transizioni NMR è minima rispetto alle energie coinvolte nelle emissioni di raggi X e gamma (1-100 Kev). In un campo magnetico di 1 Tesla, il dislivello di energia tra i protoni paralleli e antiparalleli è = 1.759 x 10-7 eV

 B0 Frequenze degli spettrometri NMR usati per alta risoluzione 200 MHz 4.7 T 300 MHz 7 T 400 MHz 9.4 T 500 MHz 11.7 T 600 MHz 14 T 900 MHZ 21 T 1 T ≈ 43 MHz In MRI medica normalmente si utilizzano spettrometri da 1-2 T

La Risonanza Magnetica Nucleare è emersa come un nuovo strumento non distruttivo e non invasivo per lo studio del metabolismo e della struttura anatomica di sistemi biologici intatti.

MRS in vivo e MRI (imaging) Sono due tecniche molto conosciute per il loro utilizzo in campo biomedico ma in realtà possono essere usate in moltissimi campi scientifici. I principi fisici fondamentali sono gli stessi dell’NMR in alta risoluzione ma le tecniche, la strumentazione e i dati ottenuti da questi esperimenti sono molto differenti. La prima differenza è la scomparsa del termine NUCLEARE dal nome delle tecniche!!!!! Le differenze fondamentali derivano dalle diversità dei “campioni” da analizzare: - omogenei in NMR alta risoluzione - assolutamente eterogenei in MRI

MRS in vivo Tra le tecnologie emergenti della Medicina di laboratorio, la spettroscopia di risonanza magnetica in vivo (MRS) è particolarmente innovativa perché consente di esplorare direttamente sul paziente e in modo non invasivo la concentrazione intracellulare di alcuni intermedi metabolici e la funzionalità di diverse vie metaboliche. Invece di ottenere immagini dettagliate di tessuti con la MRS possiamo ottenere gli spettri di composti biochimici presenti all’interno di questi tessuti!

Si valuta la funzionalità di: Con la spettroscopia RM del fosforo (31P-MRS): ATP fosfato inorganico (Pi) fosfocreatina (PCr) intermedi metabolici fosforilati (PME e PDE) concentrazione di Mg2+ pH intracellulare Si valuta la funzionalità di: fosforilazione ossidativa, glicogenolisi, glicolisi ….. Con la spettroscopia RM del protone (1H-MRS): n-acetilaspartato (NAA) colina (Cho) creatina + fosfocreatina (Cr) glutammato e glutammina (Glx) mio-inositolo (m-I) e acido lattico (LA) Si valuta la funzionalità di: sistema glutamminergico, metabolismo energetico, la osmoregolazione del SNC …….

In vivo 31P NMR di Corynebacterium glutamicum

MRI il segnale NMR I principali parametri che influenzano il segnale NMR sono: densità dei nuclei tempi di rilassamento T1 e T2 diffusione dei nuclei “chemical shift” presenza di materiali che modificano il campo magnetico locale Le immagini MR di routine sono ottenute in modo da rappresentare prevalentemente: T1, T2 e D utilizzando sequenze di impulsi opportune

MR imaging