Dipartimento di Biologia Universita’ degli Studi di Padova Mappaggio di geni malattia mediante analisi di linkage: l’esempio della Paraparesi Spastica Ereditaria

Analisi di linkage PARAMETRICA NON PARAMETRICA - Caratteri mendeliani - Preciso modello genetico modalità di eredità frequenze geniche penetranza di ciscun genotipo - Caratteri mendeliani Calcolo dei lod score (Morton 1955) - No modello genetico - Caratteri complessi ASP: Affected Sib Pairs APM: Affected Pedigree Member

Lod score - A 2 punti: probabilità di linkage tra 2 loci (MLINK) probabilità che i due loci siano associati 0<<0.5 probabilità che i due loci non siano associati  = 0.5 Lod score Z= log10 Valori soglia Z> +3 accettare il linkage Z< -2 escludere il linkage - A più punti: localizzazione del gene malattia rispetto ad una batteria di marcatori (LINKMAP, GENEHUNTER)

Paraparesi Spastica Ereditaria (HSP) Malattia neurodegenerativa Esordio variabile (II- IV decade di vita) Progressiva spasticita' degli arti inferiori Aumento dei riflessi tendinei Patogenesi: degenerazione assonale tratti corticospinali e colonna dorsale Forme non complicate Forme complicate clinica AD-HSP AR-HSP X-linked HSP SPG 3 SPG 4 SPG 6 SPG 8 SPG 9 SPG 10 SPG 12 SPG 13 SPG 5 SPG 7 SPG 11 SPG 14 SPG 1 SPG 2 SPG15 Spastina Paraplegina ETEROGENEITA’ genetica L1CAM PLP

domini caratteristici Paraplegina (Casari 1998) Spastina (Hazan 1999) SPG7 AR-HSP (De Michele 1998) mitocondrio ATPasi AAA, peptidasi M41 SPG4 AD-HSP (Hazan 1994) nucleo AAA (ATPases Associated with various cellular Activities) Locus localizzazione funzione biochimica domini caratteristici

Famiglia con HSP complicata 5 11 10 9 8 7 6 4 3 2 1 12 IV III V I II CARATTERISTICHE CLINICHE: Diagnosi: Paraparesi Spastica Ereditaria Esordio:  30 anni Altre caratteristiche: - piede cavo bilaterale - neuropatia motoria distale evidenziata da MCV nervo SPE  - disturbi cognitivi

Frequenza di ricombinazione  Esclusione dei loci noti per la HSP a trasmissione autosomica recessiva Frequenza di ricombinazione  Locus Marker 0.00 0.01 0.05 0.10 0.20 0.30 0.40 D8S260 -5.720 -0.761 -0.146 0.049 0.138 0.110 0.053 SPG5 (8p12-q13) D8S285 -6.317 -2.134 -0.879 -0.430 -0.097 0.002 0.009 D16S520 -5.698 -1.561 -0.872 -0.576 -0.276 -0.111 0.023 D16S3023 -18.262 -4.380 -2.204 -1.298 -0.520 -0.189 -0.042 SPG7 (16q24.3) D16S303 -5.696 -1.833 -1.106 -0.754 -0.365 -0.151 0.038 D15S1007 -2.20 -0.58 0.02 0.21 0.28 0.19 0.06 SPG11 (15q13-15) D15S1012 - ¥ -2.58 -1.24 -0.72 -0.27 -0.09 -0.02  

Simulazione di linkage Calcolo del lod score potenziale mediante i programmi SLINK e MSIM 1 1 0 0 1 1 2 3 1 2 0 0 2 2 1 4 1 3 1 2 1 2 3 4 1 4 1 2 2 1 2 4 1 2 3 4 1. Pedigree file Modello di eredità: autosomica recessiva Frequenza dell’allele malattia: 1:10.000 Penetranza: 100% Alleli del marcatore simulato: 5 alleli equifrequenti 2. Parameter file Max lod score potenziale Zmax = 2.82 a  = 0.0

Metodo: Genomewide Search Caratteristiche dei marcatori ABI PRISM Linkage Mapping set version 2 (PE Applied Biosystems) - 400 microsatelliti (CA repeats) distribuiti in 28 pannelli - Range di lunghezza: 69-395 basi - Elevata informatività (eterozigosità media: 0.8) - Distribuiti lungo il genoma con una distanza media di 10 cM - Marcati con molecole fluorescenti: FAM blu , HEX verde, NED giallo

Metodica utilizzata Genescan analysis 3.0 Geotyper 1.1.1 MLINK Amplificazione in piastre da 96 pozzetti Pool di marcatori per un individuo Elettroforesi su sequenziatore ABI 373 Genescan Collection Collection file Genescan analysis 3.0 Results file Geotyper 1.1.1 Lettura alleli MLINK Lod score

Genescan Analysis 3.0 file Genotyper 1.1.1 file

Linkage Reporter % di esclusione per ogni cromosoma % di Esclusione del genoma

Regioni di positività Cromosoma 1 Cromosoma 3 Cromosoma 9

Report del cromosoma 3

Analisi della regione candidata 3q27-q28 selezione di ulteriori 15 marcatori microsatelliti localizzati nella regione di interesse dalla mappa di UDB: Unified DataBase for Human Genome Mapping http://bioinformatics.weizmann.ac.il/udb/

Ricostruzione e analisi degli aplotipi cM D3S1262 2 3 2 1 D3S3651 3 2 3 1 D3S1580 1 2 2 1 D3S3530 1 3 3 2 SPG14 D3S1294 3 1 1 2 D3S2747 3 1 1 2 I (4.5cM) D3S1601 2 3 1 2 3 1 D3S3663 1 2 2 2 D3S3669 1 2 2 3 D3S2305 2 2 2 1 D3S1305 2 2 2 1 D3S1265 2 1 1 1 II 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 3 1 3 2 2 1 2 2 2 1 3 1 3 2 3 1 2 1 2 1 2 2 2 1 2 3 2 1 3 3 3 1 2 1 2 3 2 1 3 1 3 1 3 3 2 2 2 2 2 1 1 2 1 1 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 2 1 3 3 3 3 2 1 3 1 2 3 3 3 3 3 2 1 2 1 2 1 3 3 1 1 1 1 2 3 1 3 2 1 1 1 1 1 2 3 2 3 2 3 1 3 1 1 1 1 2 3 1 3 2 1 1 1 1 1 2 3 2 3 2 3 1 2 3 3 3 3 1 2 3 2 1 3 3 3 3 3 1 2 1 2 1 2 1 1 2 2 2 2 2 1 2 1 2 2 2 2 2 2 2 1 2 1 2 1 2 1 2 2 2 2 3 1 2 1 3 2 2 2 2 2 2 1 3 1 3 1 3 2 2 2 2 2 1 2 2 2 1 2 2 2 2 2 2 2 1 2 1 2 1 2 2 2 2 2 1 2 2 2 1 2 2 2 1 2 2 2 1 2 1 2 1 2 1 1 1 1 1 2 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 1

MULTIPOINT (Genehunter 1.3) Zmax = 3.9 per D3S1601 Z > 3.00 tra D3S1580 e D3S3669 Lod score

Regione cromosomica candidata Gene malattia (mutazioni patogene) Analisi di linkage Clonaggio posizionale Costruzione di mappe genetiche e fisiche ad alta risoluzione Costruzione di contigui di cloni Identificazione e sequenziamento dei trascritti Ricerca di mutazioni patogene in pazienti Mappaggio EST sequenziamento e ricerca di ORF screening di librerie di cDNA “exon trapping” ricerca di isole CpG ipometilate

Limiti del clonaggio posizionale Dimensioni della regione N° di geni presenti Limiti del clonaggio posizionale 95 96 97 98 99 Progetto Genoma Umano Mb Sviluppo di databases

Clonaggio posizionale-candidato (candidate positional cloning) Analisi della regione candidata mediante consultazione di DATABASE Individuazione dei geni noti Selezione dei geni candidati Ricerca di mutazioni patogene in pazienti Espressione Funzione omologia con altri geni umani omologia con geni in organismi modello (Topo, Drosophila...)

Regione candidata geni noti GENI NON NOTI Programmi di predizione genica Ricerca di sequenze codificanti simili Ricerca di esoni (Genscan, Grail) Pacchetti di software (NIX) Database con previsioni (GENOME BROWSER, ENSEMBL) Analisi della proteina putativa (SMART, PFAM) Ricerca di omologie Ricerca di domini Sequenze segnale

Databases

Analisi della regione critica 3q27-q28 47 cloni 70% sequenziato 6 Gap  0.1 Mb

8 Geni noti 13 UniGene Clusters (376 ESTs) 3q27 Hs.275127 Hs.34779 Hs.12251 Hs.152466 Hs.98859 Hs.63920 Hs.42824 Hs.91453 Hs.119567 Hs. 298964 Hs.25028 Hs.10198 Hs.55098 LPP: lim domain-containing preferred translocation partner in lipoma TP63: tumor protein CLDN1: claudin 1 CLDN16: claudin 16 IL1RAP: interleukin 1 receptor accessory protein FGF12/FGF12B: fibroblast growth factor 12 FLJ10718 PRO1446 8 Geni noti 13 UniGene Clusters (376 ESTs) 3q28

Omologie con altri geni Analisi dei geni noti LPP: lim domain-containing preferred translocation partner in lipoma Espressione Funzione Localizzazione Omologie con altri geni TP63: tumor protein FLJ10718 CLDN1: claudin 1 CLDN16: claudin 16 PRO1446 IL1RAP: interleukin 1 receptor accessory protein FGF12/FGF12B: fibroblast growth factor 12

FGF12 IL1RAP Espressione:  SN Altamente conservato (100% omologia nel topo) Funzione: implicato nello sviluppo e funzionamento del SN (Smallwood et al.1996) FGF12 mRNA FGF12 gene (A)n Ex 1A 3’ 5’ Ex 1B FGF12B mRNA IL1RAP Funzione: trasduzione del segnale IL1- IL1RI Simile a IL1RAPL mutata in forme di ritardo mentale e disturbi cognitivi (Carrie et al. 1999) sIL1RAP mRNA mIL1RAP mRNA IL1RAP gene (A)n 5’ 3’

Sequenziamento FGF12 e IL1RAP Risultati esclusione sequenze codificanti siti di splicing regioni 5’ e 3’ UTR Sequenziamento FGF12 e IL1RAP Valutazione delle regioni regolative per FGF12 e IL1RAP Valutazione di nuovi geni identificati nella regione critica Analisi delle ESTs e dei trscritti parziali Prospettive

Giovanni Vazza V. Sartori Francesca Boaretto G.F. Micaglio Michela Zortea Andrea Bozzato M. L. Mostacciuolo V. Sartori G.F. Micaglio Progetto finanziato dall’Universita’ degli Studi di Padova