TECNICHE DI GENETICA MOLECOLARE

Tecnologie di base •Polymerase Chain Reaction (PCR) •Sequenziamento del DNA •Endonucleasidi restrizione •Ibridazione di acidi nucleici

PCR: reazione polimerasica a catena Inventata da Kary Mullis negli anni ‘80 (premio Nobel 1993) Serve per ottenere una grande quantita’ di una specifica sequenza di DNA in vitro Puo’ amplificare un tratto di DNA per piu’ di 1 milione di volte

ELEMENTI NECESSARI ALLA REAZIONE: 1- DNA stampo che contenga la regione da amplificare 2- Due oligonucleotidi complementari a due regioni che si trovano su filamenti opposti del DNA stampo ai lati della regione che si vuole amplificare 3- Polimerasi termostabile (non viene denaturata se portata a 95°C) 4- I 4 desossinucleotidi trifosfati

IL PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO DI CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI 1- Denaturazione Il DNA stampo viene denaturato, i due filamenti si separano 95°C 2- Appaiamento I Primers si appaiano con il DNA stampo 55°-65°C 3- Sintesi E’ ottimale per il funzionamento della TAQ polimerasi 72°C

PCR: amplificazione numero cicli 1 3 10 15 20 25 30 numero sequenze bersaglio 2 256 8192 262.144 8.388.608 268.435.456 La sequenza bersaglio è la sequenza di DNA sintetizzata tra i due primers

PCR rivelazione di uno specifico mRNA …………….. RT-PCR Estrazione dell’RNA Sintesi del cDNA con la trascrittasi inversa AAAAAAAA 3’ 5’ TTTTTTTT 5’ 3’ mRNA cDNA

RETROTRASCRIZIONE SPECIFIC PRIMING OLIGO dT PRIMING RANDOM PRIMING mRNA AAAAA cDNA 3’ PRIMER mRNA cDNA AAAAA TTTTT OLIGO dT PRIMING RANDOM PRIMING mRNA cDNA AAAAA

PCR utilizzata per rivelare uno specifico mRNA: PCR in seguito a trascrittasi inversa (RT-PCR) cDNA 3’ TTTTTTTT 5’ AAAAAAAA 3’ 5’ mRNA Amplificazione della sequenza di interesse con oligonuceotidi di innesco specifici 5’ 3’ 3’ TTTTTTTT 5’ AAAAAAAA 3’ 5’ 3’ 5’ Analisi dei prodotti dell’amplificazione (elettroforesi)

SEPARAZIONE DI FRAMMENTI DI DNA IN BASE ALLE LORO DIMENSIONI ELETTROFORESI Migrazione di ioni o molecole sottoposte ad un campo elettrico applicato SEPARAZIONE DI FRAMMENTI DI DNA IN BASE ALLE LORO DIMENSIONI I frammenti più piccoli migrano più velocemente rispetto a quelli più grandi. Dopo la corsa elettroforetica i campioni di DNA vengono visualizzati ad un transilluminatore UV come bande fluorescenti mediante l’utilizzo di etidio bromuro, una sostanza fluorescente che si intercala nell’acido nucleico.

La velocità di migrazione dipende dalle dimensioni del frammento di acido nucleico Le molecole più grandi incontrano maggior resistenza nelle maglie del gel rispetto alle molecole di dimensioni più piccole Molecole più piccole migrano più velocemente Molecole più grandi migrano più lentamente

ELETTROFORESI CAPILLARE Migrazione dei campioni all’interno di un capillare Strumenti automatizzati per l’analisi di frammenti e l’analisi di sequenze Utilizzo per l’amplificazione di un primer fluorescente Vantaggi Velocità di corsa Analisi di ridotte quantità di campione Alto potere risolutivo

VANTAGGI DELLA PCR SENSIBILITA’ Si possono amplificare regioni specifiche di DNA avendo a disposizione pochissimo materiale di partenza VELOCITA’ In poche ore è possibile l’amplificazione del frammento desiderato

LIMITI DELLA PCR SENSIBILITA’ La tecnica è suscettibile di contaminazioni da parte dell’operatore o da parte di precedenti prodotti di amplificazione NECESSITA’ DI NOZIONI A PRIORI E’ necessario avere informazioni precise sulla sequenza da amplificare DIMENSIONE DEI PRODOTTI DI AMPLIFICAZIONE In condizioni standard i prodotti della PCR non possono superare le 5000 paia di basi

SEQUENZIAMENTO DIRETTO

SEQUENZIAMENTO DIRETTO Il sequenziamento degli acidi nucleici è il miglior modo per ottenere informazioni precise e definitive su un gene o una sua parte

Il metodo di Sanger si basa sul meccanismo della replicazione del DNA ELICA STAMPO T P A P Il metodo di Sanger si basa sul meccanismo della replicazione del DNA C P G P T ELICA NEOSINTETIZZATA P A P A P P P P A G

A C G T

ELETTROFEROGRAMMA

MUTAZIONE ETEROZIGOTE FORWARD REVERSE Wild-type Mutato SOSTITUZIONE C->T PRESENZA DI UN DOPPIO PICCO

Dal punto mutato si sovrappongono due diverse sequenze

ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE

ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE Enzimi che tagliano il DNA in tutti i punti che contengono una piccola e specifica sequenza di riconoscimento lunga solitamente 4-8 nucleotidi Le sequenze di riconoscimento per la maggior parte delle nucleasi di restrizione sono normalmente palindrome (la sequenza di basi è identica su entrambi i filamenti quando ciascuno di essi venga letto in direzione 5’->3’)

ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE -Sono stati isolati più di 1200 enzimi da procarioti -Riconoscono più di 130 diverse sequenze nucleotidiche (sequenze palindromiche di 4,6 o 8 nucleotidi). EcoRI E = genere Escherichia co = specie coli G/AATTC R = ceppo RY13 CTTAA/G I = prima endonucleasi isolata BamHI B = genere Bacillus am = specie amylolique faciens G/GATCC H = ceppo H CCTAG/G I = prima endonucleasi isolata

Le estremità coesive facilitano la reazione della DNA ligasi. Il taglio del DNA è perfettamente simmetrico e genera frammenti con estremità piatte. 5’ GGCC 3’ 3’ CCGG 5 HaeIII BLUNT 5’ GGATCC 3’ 3’ CCTAGG 5’ BamHI 5’-PROTRUDING Possono formare legami idrogeno tra le due code a filamento singolo complementari. Le estremità coesive facilitano la reazione della DNA ligasi. 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ EcoRI 5’ GCGC 3’ 3’ CGCG 5 HhaI 3’-PROTRUDING

La mutazione abolisce il sito di taglio Valutazione della presenza della mutazione 191C>T (Q33X) nel gene TREM2 in una famiglia con una forma di demenza precoce a trasmissione autosomica recessiva. Alleli WT,WT MUT,MUT WT,MUT ALLELE WT ALLELE MUT a b Ma r k e La mutazione abolisce il sito di taglio per l’enzima PstI

La mutazione inserisce il sito di taglio per l’enzima PstI. Valutazione della presenza della mutazione 1216C>T nell’esone 12 del gene NF2 in una famiglia con neurofibromatosi di tipo 2 (autosomica dominante). ALLELE WT a b ALLELE MUT Alleli WT,WT MUT,MUT WT,MUT La mutazione inserisce il sito di taglio per l’enzima PstI.

IBRIDAZIONE ACIDI NUCLEICI

IBRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI Ibridazione: appaiamento di 2 molecole di DNA o RNA complementari Complementarieta’: una sequenza nucleotidica S e’ la complementare di S’ se i due filamenti possono appaiarsi secondo la regola di Watson e Crick

La denaturazione non è un processo irreversibile. Infatti se dopo la separazione delle eliche si fa scendere gradualmente la temperatura, le singole eliche complementari si possono riappaiare e la doppia elica può riformarsi. Questo processo si chiama ibridazione.

Specifica sequenza di DNA marcato SONDA Specifica sequenza di DNA marcato capace di legarsi ad una sequenza complementare presente sul cromosoma

Il Southern blot permette di rivelare la presenza di specifiche sequenze di DNA in una miscela complessa di acidi nucleici. Per capillarità, la soluzione tenderà ad attraversare il gel e la membrana risalendo verso i fogli assorbenti. I sali disciolti nella soluzione trascinano i segmenti di DNA in verticale, depositandoli sullo strato del supporto solido con il quale instaurano legami elettrostatici. La membrana viene quindi separata dal gel e immersa in una soluzione contenente la specifica sonda marcata che ibriderà soltanto con le sequenze complementari presenti sul filtro permettendo la loro identificazione. Filtro di nitrocellulosa Gel Nitrocellulosa Carta assorbente Gel Spugna SOLUZIONE ALCALINA Trasferimento ~ 16 ore Ibridazione con la sonda specifica DNA digerito con endonucleasi di restrizione e sottoposto ad elettroforesi su gel d’agarosio. La denaturazione dell’acido nucleico serve per ottenere frammenti a singola elica e permettere la successiva ibridazione con una sonda

SOUTHERN BLOT NORTHERN BLOT Permette di evidenziare difetti molecolari quali delezioni e riarrangiamenti genici Il bersaglio è il DNA genomico NORTHERN BLOT Permette di stabilire il pattern di espressione del gene d’interesse Il bersaglio è costituito dall’RNA

Il “Northern blot” è una tecnica usata per determinare in quale tessuto o tipo cellulare è espresso un gene, ed anche la lunghezza e la quantità di mRNA. I livelli di mRNA sono spesso correlati ai livelli di proteina presente nel tessuto.

MOLECOLARE DI MALATTIE GENETICHE DIAGNOSI MOLECOLARE DI MALATTIE GENETICHE

TEST GENETICI CAMPIONI BIOLOGICI Sangue periferico Bulbi piliferi Mucosa orale Fibroblasti cutanei Cellule fetali Amniociti Villi coriali Sangue di cordone ombelicale Ecc. ecc.

INDAGINI CITOGENETICHE ANALISI CHE CONSENTONO LO STUDIO DELL’ASSETTO CROMOSOMICO DELLE CELLULE E QUINDI IL CARIOTIPO Ritardo mentale Anomalie congenite multiple Limite di risoluzione: 4 Mb

DIAGNOSI MOLECOLARE

DIAGNOSI MOLECOLARE INDIRETTA DIRETTA

DIAGNOSI MOLECOLARE INDIRETTA ANALISI DI LINKAGE Si adotta qualora il difetto molecolare non sia noto oppure non sia possibile identificare la mutazione in tempi ragionevoli Vengono utilizzati dei marcatori associati alla malattia e ne viene seguita la segregazione all’interno della famiglia.

MARCATORE GENETICO. locus genico che identifica MARCATORE GENETICO locus genico che identifica univocamente una regione cromosomica STABILE NELLE GENERAZIONI POLIMORFICO deve possedere almeno 2 alleli allele più raro deve avere una frequenza di almeno 1% nella popolazione FACILMENTE IDENTIFICABILE SEGREGAZIONE MENDELIANO PRESENTE IN QUALSIASI TESSUTO RFLP Minisatelliti Microsatelliti SNP MAPPA GENETICA definisce le relazioni lineari tra i marcatori molecolari

126 bp 1 128 bp 2

CAMPIONE ETEROZIGOTE INFORMATIVO (CAG)n CAMPIONE ETEROZIGOTE INFORMATIVO HapII - CAMPIONE OMOZIGOTE NON INFORMATIVO

Gene A Gene malattia aa AA aa Aa Aa aa Aa aa Aa LA DIAGNOSI CONSENTE DI STABILIRE SE IL PROBANDO HA EREDITATO O MENO DAI GENITORI I CROMOSOMI CHE PORTANO LA MUTAZIONE PATOLOGICA

DIAGNOSI MOLECOLARE INDIRETTA Distinguere i due cromosomi del genitore che possono aver trasmesso il gene patologico (si usa un marcatore strettamente associato per il quale essi siano eterozigoti) AA aa Aa Gene A Gene malattia Scoprire quale cromosoma sia stato trasmesso al probando La malattia dovrebbe essere adeguatamente mappata in modo da usare marcatori associati al locus della malattia

E’ NECESSARIA L’ANALISI DI DIVERSI MEMBRI DELLA FAMIGLIA DIAGNOSI MOLECOLARE INDIRETTA ………….LIMITI AA aa Aa Gene A Gene malattia E’ NECESSARIA L’ANALISI DI DIVERSI MEMBRI DELLA FAMIGLIA

UTILIZZO DI MARCATORI TELOMERICI E CENTROMERICI AL GENE MALATTIA DIAGNOSI MOLECOLARE INDIRETTA ………… LIMITI A malattia a normale Gene A Gene malattia EVENTUALI EVENTI RICOMBINATIVI TRA I MARCATORI ED IL GENE RESPONSABILE DELLA PATOLOGIA POSSONO RENDERE I RISULTATI INATTENDIBILI Gene A Gene malattia Gene B UTILIZZO DI MARCATORI TELOMERICI E CENTROMERICI AL GENE MALATTIA

DIAGNOSI MOLECOLARE INDIRETTA DIRETTA

QUESTO TIPO DI DIAGNOSI PUÒ ESSERE ESEGUITA SU UN SINGOLO SOGGETTO DIAGNOSI MOLECOLARE DIRETTA LA MUTAZIONE RESPONSABILE DI UNA PATOLOGIA VIENE RICERCATA E RILEVATA DIRETTAMENTE SU DNA, RNA O PRODOTTO PROTEICO DEL PROBANDO. QUESTO TIPO DI DIAGNOSI PUÒ ESSERE ESEGUITA SU UN SINGOLO SOGGETTO

SI NO TEST GENETICO SUL PROBANDO RICERCA DI MUTAZIONE MUTAZIONE IDENTIFICATA? SI NO TEST GENETICO NEI FAMILIARI A RISCHIO ANALISI DEL DNA NON INFORMATIVA PORTATORE NO TEST GENETICO NEI FAMILIARI A RISCHIO NON PORTATORE

SCELTA DEL METODO DIAGNOSTICO ETEROGENEITA’ GENETICA DIMENSIONI DEL GENE TIPI DI MUTAZIONE NUMERO DI CAMPIONI DA TESTARE RICERCA DI MUTAZIONI NOTE O IGNOTE

ETEROGENEITA’ GENETICA ETEROGENEITA’ DI LOCUS MUTAZIONI A LOCI DIVERSI PORTANO ALLA STESSA PATOLOGIA A seconda della localizzazione cromosomica e della funzione dei geni coinvolti, una stessa malattia può avere diversi meccanismi di trasmissione Retinite pigmentosa – 12 forme autosomiche dominanti – 5 forme autosomiche recessive – 3 forme legate all’X ETEROGENEITA’ ALLELICA PAZIENTI DIVERSI SONO PORTATORI DI MUTAZIONI DIVERSE ALLO STESSO LOCUS

SCELTA DEL METODO DIAGNOSTICO ETEROGENEITA’ GENETICA DIMENSIONI DEL GENE TIPI DI MUTAZIONE NUMERO DI CAMPIONI DA TESTARE RICERCA DI MUTAZIONI NOTE O IGNOTE

IDENTIFICAZIONE DI MUTAZIONI NOTE ANALISI DI RESTRIZIONE AMPLIFICAZIONE ALLELE-SPECIFICA ALLELE SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDE ASSAY (ASO) OLIGONUCLEOTIDE LIGATION ASSAY (OLA)

IDENTIFICAZIONE DI MUTAZIONI NOTE ANALISI DI RESTRIZIONE RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) Una mutazione con sostituzione di una base può creare o eliminare un sito di restrizione

Endonucleasi di restrizione EcoRI non taglierà questa sequenza

FAMILIAL MEDITERRANEAN FEVER GENE; MEFV Gene map locus 16p13

DIGESTIONE ENZIMATICA CONTROLLO DELLE DIMENSIONI DEI PRODOTTI SU GEL AMPLIFICAZIONE IN PCR DIGESTIONE ENZIMATICA CONTROLLO DELLE DIMENSIONI DEI PRODOTTI SU GEL UNCUT GENE NF2 TAC->TAG TYR-221>STOP NORMALE GTAC TAGLIO CON RsaI MUTATO GTAG PERDE IL SITO RsaI

IDENTIFICAZIONE DI MUTAZIONI NOTE AMPLIFICAZIONE ALLELE-SPECIFICA ALLELE SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDE ASSAY (ASO) OLIGONUCLEOTIDE LIGATION ASSAY (OLA)

amplificazione allele-specifica Diagnosi di mutazioni amplificazione allele-specifica C wt A mut X TAGCCAGTGACGGTTAGC ATCGGTCACTGCCAATCG TAGCCAGTGACGGTTAGA ATCGGTCACTGCCAATCT ATCGGTCACTGCCAATC G T I primers allele-specifici differiscono per il nucleotide all’estremità 3’del filamento la sintesi dell’amplificato nella reazione di PCR dipende dal corretto appaiamento di questa estremità Per ogni campione vengono allestite due reazioni di PCR utilizzando in ogni reazione il primer comune in combinazione con quello corrispondente rispettivamente alla sequenza normale e a quella mutata WT ETEROZIGOTE MUTATO WT MUT WT MUT WT MUT

ibridazione con sonde allele-specifiche Diagnosi di mutazioni ibridazione con sonde allele-specifiche

ASO WT ASO MUT Vengono sintetizzate sonde oligonucleotidiche sia per l’allele normale che per quello mutato. Il mismatch corrispondente alla mutazione si trova nella parte centrale dell’oligonucleotide così da massimizzare l’instabilità degli eteroduplex. In condizioni di ibridazione adeguatamente stringenti sonde sintetiche ibridano solo con la sequenza capace di dare appaiamento perfetto ASO MUTATO G T C A ASO WT Genotipo: +/+ +/- -/- Ibridazione: ++++ ++ -- Ibridazione: -- ++ ++++ Il DNA viene fissato su un supporto solido (membrana di nylon o nitrocellulosa), e viene ibridato sia con la sonda corrispondente all’allele normale sia con la sonda corrispondente all’allele mutato. Mutazione in omozigosi: la sonda complementare alla sequenza dell'allele normale non ibrida, Mutazione in eterozigosi: ibridano sia la sonda complementare alla sequenza dell'allele normale sia quella complementare all'allele mutato.

Reverse dot blot DF508 in CFTR gene Normal allele CFTR allele Sul filtro sono fissate le sonde oligonucleotidiche corrispondenti alle forme normali e mutate. 1 2 3 4 5 6 Sonde normali Sonde mutate IBRIDAZIONE 1 2 3 4 5 6 WT ETEROZIGOTE OMOZIGOTE ETEROZIGOTE COMPOSTO DF508 in CFTR gene Normal allele CFTR allele

METODI PER IDENTIFICARE LA PRESENZA DI MUTAZIONI IN REGIONI NON DEFINITE DEL GENE

SEQUENZIAMENTO DIRETTO Il sequenziamento degli acidi nucleici è il miglior modo per ottenere informazioni precise e definitive su un gene o una sua parte

METODI PER IDENTIFICARE LA PRESENZA DI MUTAZIONI IN REGIONI NON DEFINITE DEL GENE METODI DIAGNOSTICI ANALISI DEGLI ETERODUPLEX

Analisi degli eteroduplex. Si formano quando un frammento amplificato di DNA mutato ed uno di DNA wild-type vengono denaturati termicamente e lasciati ricombinare. ETERODUPLEX combinazione di due catene di DNA a singolo filamento non perfettamente corrispondenti, con presenza di un "rigonfiamento" dove è localizzato il mismatch. DENATURAZIONE RINATURAZIONE OMODUPLEX WT ETERODUPLEX OMODUPLEX MUT

profili di denaturazione anomali. DHPLC (Denaturing High-Performance Liquid Chromatography) SSCP (Analisi dei Polimorfismi di Conformazione delle Singole Eliche) ANALISI DEGLI ETERODUPLEX Gli eteroduplex hanno profili di denaturazione anomali.

DHPLC DENATURING HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY È una tecnica per la rilevazione di mutazioni (SNPs, inserzioni, delezioni e tandem repeat) presenti in eterozigosi. Sfrutta la differente velocità di migrazione di eteroduplex e omoduplex, in un mezzo simile ad un gel quale è la colonna HPLC. OMODUPLEX WT I duplex si formano quando un frammento amplificato di DNA mutato ed uno non mutato vengono denaturati termicamente e lasciati ricombinare La presenza di picchi aggiuntivi rispetto a quelli attesi dall'eluizione delle sole molecole omoduplici rivela la presenza di una mutazione in eterozigosi. ETERODUPLEX OMODUPLEX MUT DENATURAZIONE RINATURAZIONE

CROMATOGRAMMI DEGLI ESONI 39, 41, 6 E 23 DEL GENE DELLA DISTROFINA IN MASCHI SANI vs MASCHI AFFETTI DA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE

DENATURAZIONE E RAPIDO RAFFREDDAMENTO SSCP ANALISI DEI POLIMORFISMI DI CONFORMAZIONE DELLE SINGOLE ELICHE La mobilità elettroforetica di una particella in un gel dipende sia dalle sue dimensioni che dalla sua forma In condizioni non denaturanti il DNA a singolo filamento si ripiega in maniera dipendente dalle sue interazioni molecolari, e quindi, dalla sua sequenza. DENATURAZIONE E RAPIDO RAFFREDDAMENTO PAGE . WT MUT Nell’analisi SSCP una sequenza mutata è evidenziate dalla variazione della sua mobilità elettroforetica (causata dall’alterazione della sua conformazione secondaria) in un gel di poliacrilamide non denaturante

SSCP Singolo filamento ETERODUPLEX Doppio filamento SENSIBILITA’ 80% NEL RIVELARE SOSTITUZIONI DI SINGOLE BASI IN FRAMMENTI DI DIMENSIONI INFERIORI A 200 bp

RIARRANGIAMENTI GENOMICI SOUTHERN BLOT probe EcoRI EcoRI AA AB BB probe EcoRI EcoRI probe AA AB BB EcoRI EcoRI probe EcoRI EcoRI

Diagnosi della sindrome da androgeno resistenza per mezzo dell’analisi del Southern blot Il DNA dal gel di agarosio è stato trasferito su nitrocellulosa ed ibridizzato alla sonda cDNA di un recettore androgenetico. Si osservano 3 frammenti genomici nel DNA di entrambi i genitori ma non in quello del figlio. Conclusione: Il gene per il recettore androgenetico (AR) è X-linked. La madre ha solo un gene AR intatto (l’intensità delle bande è simile a quella della padre). Il figlio ha ereditato dalla madre il cromosoma X che ha una delezione nel gene AR.

Emocromatosi ereditaria

Emocromatosi ereditaria Autosomica recessiva Frequenza dei portatori 1/10 Omozigoti o Eterozigoti composti ~ 1 su 400 Manifestazioni cliniche 5:1 maschi:femmine Età d’insorgenza - > 40anni

Emocromatosi ereditaria Patologia da eccessivo deposito di ferro CUTE aumentata pigmentazione PANCREAS diabete ad insorgenza tardiva FEGATO cirrosi, neoplasie CUORE scompenso cardiaco IPOFISI riduzione libido/impotenza

Gene map locus 6p21.3 C282Y è la mutazione più frequente nell'emocromatosi. Presente in omozigosi nel 80-90% dei casi nelle popolazioni nord europee, (65% in Italia). ISTIDINA 63 ACIDO ASPARTICO (H63D)

Saturazione della transferrina Emocromatosi ereditaria Diagnosi biochimica Test genetico Studio del ferro Ferro sierico Saturazione della transferrina Ferritina sierica H63D C282Y His63Asp Hfe Protein Biopsia epatica Accumuli di ferro 2 microglobulin s s s s Cys282Tyr Cytosol COOH

WT Omozigote C282Y Eterozigote Composto H63D C282Y

FIBROSI CISTICA  E’ una delle più comuni malattie monogeniche, trasmessa come carattere autosomico recessivo. La sua incidenza è compresa tra 1/1.600 e 1/3.000 nella maggior parte delle popolazioni occidentali

MANIFESTAZIONI CLINICHE Respiratorie: infezioni/infiammazioni delle vie aeree inferiori e dei seni paranasali  malattia ostruttiva e insuff. respiratoria Gastrointestinali: insufficienza pancreatica con malassorbimento (90%); ileo da meconio nel 10-20% dei neonati; diabete mellito (15%) Nei maschi (>95%): azoospermia ostruttiva da anomalo sviluppo delle strutture di derivazione wolfiana (Assenza Congenita Bilaterale dei Vasi Deferenti: CBAVD)

  FIBROSI CISTICA Patologia Autosomica Recessiva Madre Portatrice Padre Portatore   Portatore 1/2 Sano 1/4 Malato 1/4

Causata da mutazioni del gene CFTR GENETICA MOLECOLARE Causata da mutazioni del gene CFTR (“Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator”), localizzato in 7q22 La proteina CFTR è un canale di trasporto ionico disposto a livello della membrana cellulare

IL GENE CFTR Struttura 250 kb - 27 esoni mRNA 6.5 kb

La gravità delle conseguenze delle mutazioni va progressivamente decrescendo dalla classe I alla classe V. I quadri più gravi di malattia sono associati alla presenza di 2 mutazioni “severe”. Gli eterozigoti composti per una mutazione severa + una lieve hanno manifestazioni più lievi (es. CBAVD isolata)

ETEROGENEITÀ ALLELICA NELLA FIBROSI CISTICA Oggi sono conosciute più di 1.000 mutazioni (la maggior parte è stata identificata in singole famiglie)

Standards and Guidelines for CFTR Mutation Testing American College of Medical Genetics Genetics in Medicine 2002; 4(5):379-391 INDICAZIONI AL TEST test diagnostico, possibile diagnosi FC test diagnostico, definire una diagnosi FC test diagnostico, neonati con ileo da meconio test diagnostico, maschi con CBAVD Test per il portatore, partner di soggetti con storia familiare positiva Test per il portatore, parner di maschi con CBAVB Test per il portatore, soggetti con storia familiare positiva Test per il portatore, donatori di gameti Diagnosi preimpianto test per diagnosi prenatale, coppie di portatori sani con un rischio 1/4 test per diagnosi prenatale, iperecogenicità intestinale nel II trimestre di gravidanza Screening neonatale

TECNICHE DI ANALISI MOLECOLARE ANALISI DI I LIVELLO L ’analisi genetica di I livello consiste nella ricerca delle mutazioni più frequenti nella popolazione. Le tecniche utilizzate devono soddisfare criteri di sensibilità del sistema,riproducibilità e rapidità, quest ’ultima in funzione del numero sempre maggiore di analisi richieste. Possono essere utilizzate tecniche “home made ” o kit commerciali ANALISI DI II LIVELLO L ’analisi genetica di II livello utilizza sistemi di “scanning ” del gene che permettono il riconoscimento di variazioni della sequenza nelle regioni codificanti e nelle giunzioni introne/esone del gene CFTR

Detection of DF508 in the cystic fibrosis gene ANALISI DI I LIVELLO Reverse Dot Blot (RDB) Oligonucleotide Specific Allele (ASO) Oligonucleotide Ligation Assay (OLA) Detection of DF508 in the cystic fibrosis gene Normal allele CF allele

MUTAZIONI INVESTIGATE OLA Screening 31 mutazioni MUTAZIONI INVESTIGATE G85E G542X 621+1GT S549N R117H S549R Y122X G551D 711+1GT R553X 1078delT R560T R347P 1898+1GA R347H 2183AAG R334W 2789 +5GA A455E R1162X DI507 3659delC DF508 3849+10KbCT 1717-1GA 3849+4AG Q493X W1282X V520F 3905insT N1303K

ANALISI DI II LIVELLO SEQUENZIAMENTO DI TUTTO IL GENE Il risultato molecolare può essere di difficile interpretazione Mutazioni causanti malattia Varianti fenotipicamente non patologiche