Tecniche analitiche per lo studio dei materiali coloranti

Tra le tecniche più idonee all’analisi di coloranti vi sono le cosiddette tecniche cromatografiche, utilizzate per separare e identificare singolarmente i componenti di una miscela Tecniche cromatografiche Il termine deriva dal greco ed è legato al suo inventore, un botanico russo di nome Tzwett (nato ad Asti), che all’inizio del XX secolo intendeva separare le sostanze coloranti della clorofilla

La prima separazione Tswett intendeva separare i pigmenti presenti nella clorofilla; riempì una colonna di vetro con carbonato di calcio, vi depositò in testa un estratto di foglie verdi ed eluì con solfuro di carbonio: i vari pigmenti si separarono in bande colorate Tswett chiamò questa procedura cromatografia dal greco scrittura del colore o, visto il significato del suo cognome in russo, scrittura di Tswett

Queste tecniche sono molto varie, ma si basano tutte su un principio comune: esse sfruttano la differenza di interazione dei componenti di una miscela nei confronti di un supporto statico, la fase fissa o stazionaria, e di un supporto dinamico, la fase mobile o eluente, che fluisce attraverso la fase fissa trascinando le sostanze componenti la miscela. Durante l’attraversamento, detto processo di eluizione, i componenti subiscono un rallentamento più o meno marcato a seconda della loro affinità per la fase fissa ed escono da essa a tempi diversi, in modo da poter essere identificati uno per uno. Le sostanze che compongono la miscela vengono identificate mediante un rivelatore posto all’uscita dalla fase fissa che registra le modifiche di alcune proprietà chimico-fisiche. Il responso che si ottiene si chiama cromatogramma Principi della cromatografia

Le tecniche cromatografiche sono sempre distruttive (anche se in senso strettamente analitico possono in alcuni casi essere non distruttive), in quanto operano esclusivamente su campioni in soluzione o in fase vapore: i materiali oggetto di analisi vanno quindi disciolti in un opportuno solvente, che deve essere compatibile con il sistema cromatografico disponibile Non è possibile l’analisi senza prelievo di campione né tanto meno l’analisi in situ; disponendo di strumenti miniaturizzati è possibile operare in loco ma sempre lavorando su un prelievo Nonostante questa premessa scoraggiante, è bene precisare che il consumo di campione è minimo. Sono sufficienti da 1 ml a 1 µl di soluzione, corrispondenti a pochi mg di campione solido Cenni preliminari

Tipi di cromatografia I due gruppi principali di tecniche cromatografiche sono: Inoltre, a seconda del tipo di supporto della fase stazionaria si può avere: la cromatografia liquida, nella quale la fase mobile è liquida e la fase fissa è solida o liquida la cromatografia liquida, nella quale la fase mobile è liquida e la fase fissa è solida o liquida la gascromatografia, nella quale la fase mobile è gassosa e la fase fissa è solida o liquida la gascromatografia, nella quale la fase mobile è gassosa e la fase fissa è solida o liquida cromatografia planare (su carta, su strato sottile) cromatografia planare (su carta, su strato sottile) cromatografia su colonna cromatografia su colonna

Nella cromatografia liquida (LC) la fase fissa è una colonna o un supporto planare contenente il materiale attivo, la fase mobile è un liquido; essa è utilizzata per la separazione di sostanze poco volatili come idrocarburi ad alto peso molecolare, molecole biologiche (proteine, grassi), sostanze ioniche o ionizzabili (anioni, amine, zuccheri) Cromatografia liquida Particolarmente usate sono la cromatografia ad alta pressione o HPLC per la separazione di sostanze neutre e la cromatografia ionica (IC) per la separazione di sostanze ioniche

Cromatografia planare Si tratta di un gruppo di tecniche di cromatografia liquida di semplicissima applicazione, spesso impiegate per avere informazioni preliminari. La fase stazionaria è supportata su lastre di vetro, fogli di alluminio o di plastica nella versione TLC (Thin Layer Chromatography) e su fogli di carta da filtro nella versione PC (Paper Chromatography) Le fasi stazionarie più usate sono il gel di silice e l’allumina per la cromatografia di adsorbimento, la cellulosa per la ripartizione liquido-liquido (in questo caso la fase stazionaria è l’acqua adsorbita sulle particelle di cellulosa)

L’esecuzione dell’analisi è molto semplice: la miscela da separare va depositata sulla superficie, posandone con un tubo capillare una goccia su una linea che segna l’inizio del processo di eluizione Quindi il foglio o la lastrina si pongono in una vaschetta contenente la fase mobile che per gravità (modalità discendente), per capillarità (modalità ascendente) o per diffusione laterale (modalità orizzontale) fluisce sulla fase fissa trascinando gli analiti e separandoli

ritardo. Per ogni analita il valore di Rf si ottiene misurando la distanza percorsa dal centro della macchia e confrontandola con la distanza percorsa dal fronte dell’eluente: Rf = d analita / d eluente Il valore di Rf degli analiti è quindi sempre compreso tra 0 e 1. I valori ottimali sono compresi tra 0.4 e 0.8 Il risultato è (spesso ma non sempre) visualizzabile sotto forma di macchie colorate, ognuna dovuta ad un componente della miscela. Il riconoscimento delle sostanze può avvenire effettuando separazioni su miscele standard; in questo caso il parametro che caratterizza i soluti separati è il cosiddetto Rf o fattore di

Esempio: pigmenti fogliari Nella figura è mostrata la separazione per cromatografia su carta orizzontale di pigmenti fogliari da un estratto della pianta Cisto bianco; si tratta dei pigmenti che fanno cambiare il colore delle foglie nelle diverse stagioni. La separazione è ottenuta con un disco di carta da filtro come fase fissa e alcol etilico al 95 % come fase mobile. Gli aloni sono attribuiti alle diverse sostanze sulla base del loro comportamento chimico: le sostanze più idrosolubili (e quindi più affini all’acqua adsorbita sulla cellulosa, che costituisce la fase fissa) sono quelle al centro, cioè clorofille A e B; le sostanze meno idrosolubili, xantofilla e carotina, migrano all’esterno in quanto più affini alla fase mobile

L’identificazione dei vari coloranti è possibile soltanto confrontando gli Rf di standard a composizione nota, ed è essenziale avere informazioni sul maggior numero possibile di sostanze. Infatti i coloranti tessili anticamente erano spesso impiegati in miscela: il colore risultante era ottenuto dal contributo di più sostanze coloranti. Inoltre possono essere presenti sostanze non colorate aventi altre funzioni (es. leganti, conservanti) Separazione di coloranti tessili Nella figura è mostrata la separazione per TLC di coloranti rossi di uso tessile, provenienti da insetti

Separazione di coloranti porpora Separazione per PC di estratti in etanolo da molluschi, appartenenti a specie impiegate in antichità per ottenere coloranti porpora: Dicathais orbita Dicathais orbita Murex brandaris Murex brandaris Murex trunculus Murex trunculus Purpura haemastoma Purpura haemastoma Murex erinaceus Murex erinaceus Rapana bezoar Rapana bezoar I valori di Rf sono confrontati con un composto indigoide, il potassio indossil solfato (K.I.S., a sinistra)

Cromatografia liquida su colonna I primi esperimento di cromatografia su colonna utilizzavano colonne di vetro di 1-5 cm di diametro e lunghezza fino a 5 metri. Ciò richiedeva tempi di separazione molto lunghi Attualmente è possibile realizzare microcolonne di pochi cm di lunghezza, in grado di separare in pochi minuti molte sostanze. Queste colonne sono costituite da particelle di 1-5 µm di diametro, che richiedono pressioni molto alte per forzare il passaggio della fase mobile attraverso la colonna. Per sistemi di questo genere il termine utilizzato è cromatografia liquida ad elevate prestazioni o elevate pressioni (HPLC, High Performance o Pressure Liquid Chromatography)

Strumentazione per HPLC Un cromatografo HPLC è costituto dalle seguenti parti: riserva di solventi: uno o più solventi che possono essere utilizzati singolarmente o in miscelariserva di solventi: uno o più solventi che possono essere utilizzati singolarmente o in miscela pompa con pressione fino a 400 Atm, flusso stabile tra 0.1 e 10 ml/minpompa con pressione fino a 400 Atm, flusso stabile tra 0.1 e 10 ml/min sistema di iniezione costituito da una valvola a più vie e da un circuito a volume fisso, o loop, nel quale si mette il campionesistema di iniezione costituito da una valvola a più vie e da un circuito a volume fisso, o loop, nel quale si mette il campione colonna cromatografica e precolonnacolonna cromatografica e precolonna rivelatore per monitorare gli eluatirivelatore per monitorare gli eluati PC per gestire il sistema e i datiPC per gestire il sistema e i dati

Separazione di coloranti tessili Nella figura sottostante è mostrata la separazione e identificazione di composti usati per la tintura di un manufatto di seta rossa Copto (VII-IX secolo d.C.) Con una tecnica spettroscopica non sarebbe stato possibile caratterizzare pienamente una miscela così complessa, comprendente coloranti e additivi 1 – Acido gallico (tannini) 2 – Acido laccaico B 3 – Cocciniglia Armena 4 – Acido ellagico (tannini) 5 – Acido laccaico A 6 – Luteolina (Lacca di gualda) 7 – Apigenina (Lacca di gualda) 8 – Alizarina (Robbia) 9 – Purpurina (Robbia)

Porpora di Tiro (A) miscela standard contenente (a) indaco, (b) indirubina, (c) 6- bromoindaco, (d) 6-bromoindirubina, (e) 6,6'-dibromoindaco e (f) 6,6'- dibromoindirubina; (B) un estratto da Nucella lapillus

Degradazione di un colorante Monitoraggio del processo di degradazione fotolitica del colorante indigotina o indaco (picco a 17 minuti) che è convertito dalla luce a isatina (picco a 7.5 minuti) I cromatogrammi sono relativi a) al colorante fresco; b) dopo 7 giorni; c) dopo 30 giorni h

Nella figura è riportato uno schema di analisi

Recentemente, uno sviluppo importante della tecnica HPLC è stato l’interfacciamento alla spettrometria di massa per ottenere strumenti LC-MS, in modo da poter avere in ogni istante lo spettro di massa delle sostanze separate Tecnica LC-MS La tecnica LC-MS consente di avere informazioni di tipo strutturale sulle molecole separate e quindi permette di riconoscere in maniera più efficiente i vari composti. Quasi sempre, infatti, i coloranti e i pigmenti moderni di natura organica sono composti da miscele complesse, contenenti numerose sostanze diverse

Coloranti per arazzi In alto è riportato il cromatogramma ottenuto analizzando un estratto da una fibra blu di un arazzo giapponese del XIX secolo, con rivelatore UV-Vis a 620 nm. Il picco a 17 minuti (2) è dovuto all’indaco ma il picco a 10 minuti (1) è incognito ed è identificato soltanto impiegando il rivelatore MS, dal cui spettro risulta essere il composto blu di metilene

Ioni molecolari e principali bande di assorbimento UV-Visibile di alcuni composti indigoidi Cromatogrammi di una miscela di indigoidi con rivelatore DAD e MS

Nella gascromatografia (GC) la fase fissa è una colonna contenente il materiale attivo e la fase mobile è un gas; essa è utilizzata per la separazione di sostanze volatili o volatilizzabili come idrocarburi a basso peso molecolare, aromi, acidi organici. Tra le varie versioni, particolarmente utilizzata in campo archeometrico è la gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS) che consente di avere informazioni strutturali sulle sostanze separate Gascromatografia Le applicazioni nel campo dei materiali coloranti sono limitate alle sostanze volatili o volatilizzabili, quindi a pigmenti o coloranti organici

Esempi di strumenti GC-MS Strumenti per gascromatografia GC-MS da banco GC-MS portatile

cromatogramma tempo di ritenzione spettro di massa m/z Esempio di cromatogramma GC-MS m/z

Il materiale in questione è di natura chimica estremamente complessa: si tratta infatti di un pigmento impiegato a partire dal XIX secolo a base di asfalto, in cui sono presenti, al’interno di un reticolo polimerico, composti quali alcheni e alcani, alchilbenzeni, alchilnaftaleni, alchilantraceni, alchilfenantreni e molti altri Il pattern delle sostanze presenti sembra indicare che la provenienza della materia prima sia l’asfalto del Mar Morto (Israele) Analisi di un pigmento bituminoso

La tecnica GC-MS è adatta alla separazione e identificazione di quasi tutte le sostanze provenienti dai materiali organici, tranne per quelle ad alto peso molecolare, che non possono essere volatilizzate, e per quelle insolubili nei comuni solventi. Un esempio di sostanze non separabili è dato dai moderni pigmenti e coloranti sintetici, che sono spesso costituiti da molecole ad alto PM Gascromatografia con pirolisi L’identificazione di queste sostanze può essere agevolata da una tecnica di pretrattamento nota come pirolisi, in cui le molecole da separare sono preventivamente pirolizzate ad alta temperatura in assenza di ossigeno, generando frammenti a pesi molecolari inferiori rispetto alle molecole progenitrici, che risultano separabili e identificabili in base al pattern di frammentazione caratteristico per ogni sostanza. La tecnica analitica si chiama Py-GC-MS (Pyrolysis-Gas Chromatography-Mass Spectrometry) ed è stata recentemente applicata alla caratterizzazione di pigmenti moderni a base organica, di resine sintetiche e di altri leganti classici

Cromatogramma ottenuto mediante Py-GC-MS di un pigmento azoico noto come Naphtol Crimson (PR170, C.I ). I picchi a, b, c, d sono relativi a frammenti che permettono di risalire alla molecola progenitrice (dx). Sono presenti inoltre picchi relativi al legante, una resina acrilica, e a prodotti formatisi a seguito della pirolisi