Computational analysis of data by statistical methods Metodi per lo studio dell’espressione genica su larga scala: ESTs SAGE Microarray MICROARRAY SAGE EST Computational analysis of data by statistical methods

ESPRESSIONE DEL GENOMA UMANO NELLE CELLULE DIFFERENZIATE Tutte le cellule di un organismo hanno lo stesso corredo genomico L’espressione genica tessuto specifica determina il fenotipo morfo-funzionale dei tipi cellulari e tissutali In ogni cellula differenziata ed in ogni particolare momento dello sviluppo e’ attivo solo un sottoinsieme di geni

REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA Puo’ agire su ciascuno dei livelli che caratterizzano il passare dell’informazione genica dal DNA alle proteine Negli Eucarioti superiori la regolazione dell’espressione genica si svolge principalmente come controllo della trascrizione Principali tipi di regolazione: Controllo epigenetico Controllo trascrizionale Controllo post-trascrizionale

“Large-scale approach” “One-gene approach” Il gene di interesse e’ espresso in un tessuto o in un dato momento dello sviluppo ? Quanto e’ attivo dal punto di vista trascrizionale ? Real Time PCR PCR semiquantitativa Ibridazione DNA genico o cDNA con RNA totale o poly(A)+RNA (Northern blot) Ibridazione in situ “Large-scale approach” Quali geni sono espressi in un tessuto ed in un dato momento dello sviluppo ? Quanto ciascuno di essi e’ attivo dal punto di vista trascrizionale ? Profilo d’espressione del genoma (TRASCRITTOMA)

METODI PER LO STUDIO SU LARGA SCALA DELL’ESPRESSIONE GENICA Sequenziamento sistematico di ESTs da librerie di cDNA SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) cDNA microarrays

EST EST SEQUENCING mRNA of different genes cDNA LIBRARY

ESTIMATE OF THE LEVEL OF EXPRESSION OF A GIVEN GENE UniGene Human Release Statistics Total sequences in clusters: 3115711 Total number of clusters sets: 95928 22094 sets contain at least one known gene 94710 sets contain at least one EST 20876 sets contain both genes and ESTs ESTIMATE OF THE LEVEL OF EXPRESSION OF A GIVEN GENE Sample of 12919 ESTs corresponding to 4460 genes/trascripts eg. Rhodopsin: 65 retina ESTs  65 / 12919 = 0.503%

EST

EST

SAGE Serial Analysis of Gene Expression SAGE è un metodo sperimentale ideato per utilizzare i vantaggi del sequenziamento su larga scala per avere informazioni quantitative di espressione genica (Velculescu et al. 1995, Zhang et al, 1997) Con questa tecnica e’ possibile stimare il livello d’espressione di ciascun gene, attraverso la misura del numero di volte in cui la TAG che lo rappresenta compare in un campione abbastanza grande di TAGs sequenziate a partire dal messaggero del tessuto in analisi Tag to Gene mapping  Gene to Tag mapping Consiste nel sequenziamento da messaggeri cellulari di brevi oligonucleotidi, che fungono da etichette di sequenza (TAG)

SAGE una sequenza di 9 paia di basi permette di identificare 49 (262144) diversi trascritti (una "tag" viene ottenuta da una posizione specifica di ogni trascritto). le "tag" possono essere unite insieme in serie, a costituire lunghe molecole di DNA, che vengono clonate e sequenziate. il numero di volte in cui una singola "tag" viene osservata permette di quantificare l'abbondanza del messaggero identificato nella popolazione dei messaggeri e, indirettamente, il livello di espressione del gene corrispondente.

Esperimenti di Microarray Permettono l’analisi dell’espressione di migliaia di geni simultaneamente

MICROARRAY

GeneChip Affymetrix Ibridizzazione della sonda marcata Scansione del GeneChip con scanner laser

Analisi dell’immagine MICROARRAY Analisi dell’immagine Identificazione della posizione degli spot Costruzione di un’area locale intorno ad ogni spot Calcolo dell’intensità di ogni singolo spot Calcolo del background locale

MICROARRAY Elaborazione dei dati

EST SAGE MICROARRAY

Matrice dei risultati con più condizioni sperimentali … Cond. m Gene 1 x11 x12 x1m Gene 2 x21 x22 x2m Gene n xn1 xn2 xnm Quali geni sono differenzialmente espressi ? Quali e quanti geni sono coespressi?

Obiettivi dell’analisi saranno… Identificazione geni differenzialmente espressi Identificazione pattern di espressione comuni Identificazione di geni coespressi con geni di funzione nota

I geni sono punti nello spazio: CLUSTER ANALISI Identificazione di gruppi di geni con profili di espressione simili Simili rispetto a cosa ? distanza Definizione di I geni sono punti nello spazio: punti vicini nello spazio sono raggruppati insieme

CLUSTER ANALISI Misura di similarita’ Linking method DUE STEPS: Diverse misure Standardizzazione dei dati Linking method criterio per stabilire i gruppi Metodi gerarchici e non gerarchici