Docente: Dr. Stefania Bortoluzzi Dipartimento di Biologia Universita' di Padova viale G. Colombo 3, 35131, Padova Tel Corso di Laurea in Biologia Sanitaria Universita' di Padova C.I. DI METODI STATISTICI PER LA BIOLOGIA, INFORMATICA E LABORATORIO DI INFORMATICA (MOD. B ) ore

III LEZIONE Dati d'espressione genica: ESTs SAGE Microarray NCBI GEO

ESPRESSIONE DEL GENOMA UMANO NELLE CELLULE DIFFERENZIATE Tutte le cellule di un organismo hanno lo stesso corredo genomico L’espressione genica tessuto specifica determina il fenotipo morfo-funzionale dei tipi cellulari e tissutali In ogni cellula differenziata ed in ogni particolare momento dello sviluppo e’ attivo solo un sottoinsieme di geni

REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA Puo’ agire su ciascuno dei livelli che caratterizzano il passare dell’informazione genica dal DNA alle proteine Negli Eucarioti superiori la regolazione dell’espressione genica si svolge principalmente come controllo della trascrizione Principali tipi di regolazione: Controllo epigenetico Controllo trascrizionale Controllo post-trascrizionale

“One-gene approach” Il gene di interesse e’ espresso in un tessuto o in un dato momento dello sviluppo ? Quanto e’ attivo dal punto di vista trascrizionale ? Profilo d’espressione del genoma (TRASCRITTOMA) Quali geni sono espressi in un tessuto ed in un dato momento dello sviluppo ? Quanto ciascuno di essi e’ attivo dal punto di vista trascrizionale ? “Large-scale approach” Real Time PCR PCR semiquantitativa Ibridazione DNA genico o cDNA con RNA totale o poly(A)+RNA (Northern blot) Ibridazione in situ

METODI PER LO STUDIO SU LARGA SCALA DELL’ESPRESSIONE GENICA Sequenziamento sistematico di ESTs da librerie di cDNA SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) cDNA microarrays

mRNA of different genes cDNA LIBRARY EST SEQUENCING EST

Il sequenziamento del DNA “codificante” si basa sulla purificazione dell'RNA messaggero da cellule o da campioni di tessuto e sulla sua retrotrascrizione in vitro in una sequenza di DNA complementare (cDNA). In genere i cDNA vengono frammentati e clonati in vettori batterici. Si ottengono in questo modo delle collezioni di batteri, nelle quali ogni colonia contiene un inserto corrispondente ad un frammento di sequenza di un gene espresso, dette librerie di cDNA. EST

Utilità delle EST  Scoperta di nuovi geni  Mappaggio di nuovi geni  Identificazione degli esoni lungo estese sequenze genomiche (Gene Prediction)  Studio dello splicing alternativo EST

 Una libreria di cDNA, che viene preparata dal messaggero contenuto nelle cellule di uno specifico tessuto, può essere considerata come un' istantanea che riproduce la composizione della popolazione dei messaggeri presenti nel tessuto in un particolare momento dello sviluppo dell'organismo e in determinate condizioni fisiologiche.  Le librerie di cDNA in cui i cloni da sequenziare vengono scelti in modo casuale e sulle quali non vengono effettuate né operazioni di sottrazione né di normalizzazione, possono essere usate per descrivere, sia qualitativamente sia quantitativamente, la popolazione dei messaggeri. EST

ESTIMATE OF THE LEVEL OF EXPRESSION OF A GIVEN GENE Sample of ESTs corresponding to 4460 genes/trascripts eg. Rhodopsin: 65 retina ESTs  65 / = 0.503% UniGene Human Release Statistics Total sequences in clusters: Total number of clusters sets: sets contain at least one known gene 94710sets contain at least one EST 20876sets contain both genes and ESTs EST

SAGE Serial Analysis of Gene Expression SAGE è un metodo sperimentale ideato per utilizzare i vantaggi del sequenziamento su larga scala per avere informazioni quantitative di espressione genica (Velculescu et al. 1995, Zhang et al, 1997) Con questa tecnica e’ possibile stimare il livello d’espressione di ciascun gene, attraverso la misura del numero di volte in cui la TAG che lo rappresenta compare in un campione abbastanza grande di TAGs sequenziate a partire dal messaggero del tessuto in analisi Tag to Gene mapping  Gene to Tag mapping Consiste nel sequenziamento da messaggeri cellulari di brevi oligonucleotidi, che fungono da etichette di sequenza (TAG) SAGE

Il metodo si basa su tre principi:  una sequenza di 9 paia di basi permette di identificare 4 9 (262144) diversi trascritti, dal momento che una "tag" viene ottenuta da una posizione specifica di ogni trascritto (  12bp)  le "tag" possono essere unite insieme in serie, a costituire lunghe molecole di DNA, che vengono clonate e sequenziate in modo automatizzato  il numero di volte in cui una singola "tag" viene osservata permette di quantificare l'abbondanza del messaggero identificato nella popolazione dei messaggeri e, indirettamente, il livello di espressione del gene corrispondente. SAGE Una TAG e’ una sequenza di lunghezza definita direttamente adiacente al 3’ del sito di restrizione piu’ 3’, nel messaggero da cui proviene, per l’enzima utilizzato (spesso NIaIII)

SAGE Taglio con enzima di restrizione ed isolamento della porzione 3’ del cDNA per purificazione mediante sfere a streptavidina Clonaggio dei concatameri e sequenziamento Sintesi DNA a doppia elica a partire dai messaggeri con primer oligo(dT) biotinilato Separazione del cDNA in 2 aliquote, ciascuna ligata con un linker diverso, contenente un sito di taglio per un enzima di restrizione (tagging enzyme) che taglia ad una distanza definita dal sito riconociuto (20bp) Il linker con attaccato un breve tratto di cDNA (9-12 bp) viene rilasciato Ligazione tags a due a due, taglio ditags in modo da creare estremita’ coesive Analisi automatizzata dei risultati: identificazione di tutte le specie di tags, conteggio della frequenza di ciascuna, assegnazione a sequenze geniche note ed annotazione

SAGE

 Il risultato della SAGE e’ di tipo digitale: una lista di tags e la frequenza di ciascuna di esse  La fase in cui si stabilisce la corrispondenza tra tag e gene e’ cruciale per una corretta stima del livello d’espressione del gene  La corrispondenza tag-gene non e’ sempre biunivoca, come ci si aspetterebbe  Gli errori di sequenziamento hanno effetti molto pesanti sui dati SAGE (1%  10% che ci sia almeno 1 errore su 10 bp)  Le assegnazioni tag/EST sono affette da un errore maggiore SAGE

Esperimenti di Microarray Permettono l’analisi dell’espressione di migliaia di geni simultaneamente MICROARRAY

Misura dell’espressione dei geni con i microarray Gene 1 Gene 2 = malato = sano MICROARRAY

Analisi dell’immagine Identificazione della posizione degli spot Costruzione di un’area locale intorno ad ogni spot Calcolo dell’intensità di ogni singolo spot Calcolo del background locale MICROARRAY

DNA Microarray per lo studio dell’espressione genica

Probeset Affymetrix

GeneChip Affymetrix Ibridizzazione della sonda marcataScansione del GeneChip con scanner laser

Elaborazione dei dati MICROARRAY

SAGEEST

Matrice dei risultati con più condizioni sperimentali Cond. 1Cond. 2 … Cond. m Gene 1 x 11 x 12 …x 1m Gene 2 x 21 x 22 …x 2m … ………… Gene n x n1 x n2 …x nm Quali geni sono differenzialmente espressi ? Quali e quanti geni sono coespressi?

Obiettivi dell’analisi saranno…  Identificazione geni differenzialmente espressi  Identificazione pattern di espressione comuni  Identificazione di geni coespressi con geni di funzione nota

CLUSTER ANALISI Identificazione di gruppi di geni con profili di espressione simili Simili rispetto a cosa ? Definizione di distanza I geni sono punti nello spazio: punti vicini nello spazio sono raggruppati insieme

DUE STEPS: Misura di similarita’ Diverse misure Standardizzazione dei dati Linking method criterio per stabilire i gruppi Metodi gerarchici e non gerarchici CLUSTER ANALISI