NEI SOLI USA CI SONO DA 6 A 80 MILIONI DI PERSONE OGNI ANNO COLPITI DA MALATTIE DI ORIGINE ALIMENTARE CON 9.000 DECESSI ED UN COSTO SOCIALE DI CIRCA 5 MILIARDI DI DOLLARI

LO STUDIO DELLA MICROBIOLOGIA ALIMENTARE Provenienza e significato delle varie specie microbiche presenti Comportamento microbico durante i processi tecnologici Influenza durante la conservazione Particolari gruppi microbici che determinano l’insorgenza di malattie

INFORMAZIONI RICAVATE DALLA MICROBIOLOGIA ALIMENTARE Stabilire le fonti di contaminazione Valutare il rispetto delle norme igieniche Valutare le condizioni di conservazione Seguire l’esatto susseguirsi di certi processi industriali Eliminare del commercio i prodotti contaminati

ESAME BATTERIOLOGICO DEGLI ALIMENTI Obiettivo primario: assicurare la tutela della salute del consumatore cioè dimostrare l’assenza di germi patogeni Limiti distribuzione non omogenea dei batteri patogeni nel prodotto presenza di germi patogeni in basse concentrazioni presenza di agenti patogeni non batterici Questi limiti si possono in parte risolvere con: La ricerca di germi indice di contaminazione. Requisiti di un germe indice di contaminazione: avere la stessa nicchia ecologica del patogeno; avere la stessa modalità di trasmissione del patogeno; essere presente in numero elevato; essere facilmente rilevabile. Germi indice di contaminazione fecale 1) Coliformi 2) Enterococchi 3) Clostridi solfito-riduttori

Il “nostro” laboratorio batteriologico…

LE PROCEDURE BUROCRATICHE PER APRIRE UN NUOVO LABORATORIO DI ANALISI CHIMICHE

I principali “permessi” da richiedere alle autorità competenti: Idoneità dei locali di competenza del Comune (destinazione per esercizio commerciale) Adempimenti dei Vigili del Fuoco in riferimento alla presenza di solventi (D.P.R. 27 aprile 1955 n° 547)

I principali “permessi” da richiedere alle autorità competenti: Adempimenti per gli impianti elettrici di competenza del servizio Igiene e Ambiente della ASL (ex ENPI L. 46/90) Adempimenti per le sostanze radioattive di competenza delle Regioni ( L. 1860 del 31.12.1962)

I principali “permessi” da richiedere alle autorità competenti: Stoccaggio e preparazione di prodotti chimici di competenza delle ASL Stoccaggio e preparazione di additivi chimici per prodotti alimentari di competenza delle Regioni (DPR 327 del 26.03.1980

I principali “permessi” da richiedere alle autorità competenti: Autorizzazione allo scarico di competenza comunale Smaltimento dei rifiuti (D.L.vo n° 22/97) Richiesta di emissione di fatture con IVA

Fattori che possono incidere sui risultati delle analisi microbiologiche: la preparazione specifica, l’esperienza e l’interesse dell’analista l’idoneità delle apparecchiature ed il loro stato di manutenzione l’accuratezza di preparazione dei terreni di coltura e la qualità dei loro componenti

Qualsiasi schema di analisi, anche se completo, dettagliato e ben eseguito, ha bisogno di un razionale criterio di campionamento. Questo perché i risultati ottenuti, dall’esame di una sua aliquota, dovranno essere estrapolati ad un intero lotto o partita di alimento.

CAMPIONAMENTO a) Unità campionarie (o di campionamento = u.c.): singola aliquota o confezione di alimento, scelta casualmente e sulla quale si eseguiranno le opportune analisi; b) Lotto (o partita): con questo termine si intende, per convenzione, una quantità di alimento prodotta e confezionata in condizioni uniformi entro un limitato periodo di tempo (per esempio: giornata lavorativa, turno di lavoro, ecc.). Risulta evidente che quanto meno uniformi sono le condizioni di produzione, tanto minore deve essere, ai fini di una maggiore omogeneità, il suddetto lasso di tempo preso in considerazione ai fini del campionamento; c) Campione rappresentativo: quello le cui condizioni di produzione si avvicinino, sotto il profilo quali-quantitativo quanto più possibile a quelle di tutto il lotto dal quale è stato prelevato; d) Campione casuale: insieme di unità campionarie selezionate da un lotto precedentemente definito, seguendo un procedimento che assicuri ad ogni unità la medesima probabilità di essere prelevato.

I valori guida sono espressi dai seguenti simboli: Piano di campionamento elaborato da I.C.M.F.S. (International Committee Microbiological Foods Standardization) I valori guida sono espressi dai seguenti simboli: m = indica il limite prefissato per una determinata caratteristica microbiologica dell’alimento in esame. (es.: i valori di carica microbica saprofitaria) M = indica valori superiori a quello sopra indicato, non eccedenti tuttavia un determinato livello. c = indica il numero di aliquote componenti il campione in esame nei quali è consentito il raggiungimento dei valori indicati da M. n = indica le aliquote di prodotto componenti il campione in esame.

Classificazione dei campioni in esame ACCETTABILI: con valori inferiori ad “m”. 2. PARZIALMENTE ACCETTABILI: con valori compresi tra “m” e “M”. 3. INACCETTABILI: con valori superiori ad “M”. La severità di un piano di campionamento dipende direttamente dai valori che si attribuiscono ad “n” e “c”

Valori soglia [oltre il quale possono insorgere tossinfezioni alimentari e malattie infettive] AGENTE Livello soglia per popolaz. sana Salmonella <105 Tossina stafilococcica <1 mcg Clostridium perfrigens 106 Campylobacter Vibrio cholera Shigella 101 – 102 H.A.V. 103 Yersinia 109 Norwalk virus 10

Terreno di coltura AGAR: Acqua Elementi nutrizionali Sostanze inibenti Estratto di alga rossa Solidifica a 42°C Non è digeribile Acqua Elementi nutrizionali Sostanze inibenti

Schema di controllo delle operazioni per la preparazione dei terreni di coltura

L’impiego di metodi analitici non idonei può comportare il conseguimento di falsi risultati sia negativi che positivi. I primi costituiscono un problema di salute pubblica; i secondi producono ingiustificati danni di natura economica e giuridica.

Tecnica delle membrane filtranti

Membrane filtranti SVANTAGGI ENUMERAZIONE BATTERICA Membrane filtranti SVANTAGGI Eccessiva selettività dei terreni ( e temperature) Interferenza da materiale in sospensione ostruzione dei pori può provocare un film di crescita Più batteri formanti una colonia (U.F.C.) Errori di laboratorio bolle d’aria terreno scarso dischetti sommersi

Membrane filtranti VANTAGGI rapidità dei risultati (24/48 h) ENUMERAZIONE BATTERICA Membrane filtranti VANTAGGI rapidità dei risultati (24/48 h) maggiore accuratezza e precisione riduzione dello spazio occupato < laboriosità di esecuzione esami di volume maggiori di acqua possibilità di rilevare la presenza di batteri diversi da quelli ricercati

Metodo della conta in piastra

Tecnica per inclusione 1 2 3 4 5 6

ENUMERAZIONE BATTERICA Formula di Poisson: X = numero di germi stimato per ml Ci = totali germi contati per ogni diluizione Ni = piastre per diluizione Zi = diluizione

VALUTAZIONE DELL’ATTENDIBILITA’ DELLA CONTA SECONDO LE MEDIE DI POISSON C2= conte batteriche con minor numero di CFU C1= conte batteriche con maggior numero di CFU

Prova presuntiva Prova conclusiva conferma + - Most Probable Number

Indice MPN

ENUMERAZIONE BATTERICA Formula di Thomas per MPN P = numero di tubi positivi N = volume del campione nei tubi negativi T = volume totale del campione inoculato in tutti i tubi X = numero di germi per 100 ml

Tecnica MPN SVANTAGGI Metodica lenta (48-96 h) e laboriosa ENUMERAZIONE BATTERICA Tecnica MPN SVANTAGGI Metodica lenta (48-96 h) e laboriosa Procedimento costoso Manca di precisione nei risultati I risultati possono essere inficiati da fenomeni di interferenza dovuti alla presenza nel campione di: Elevata concentrazione di nitrati che inibisce l’attacco fermentativo dei coliformi agli zuccheri (EFFETTO ANAEROGENICO) Flora microbica concorrente

D. lgs. n° 31 del 2 febbraio 2001 Attuazione della direttiva 98/83 CE relativa alle acque destinate al consumo umano

SISTEMA di QUALITA’: si tratta della famiglia di standard (ISO 9000) (International Standardisation Organisation – Ente Mondiale di Normazione) ha emesso fin dal 1987 una famiglia di standard (NORME) che definiscono le prescrizioni da adottare in azienda per realizzare un SISTEMA di QUALITA’: si tratta della famiglia di standard (ISO 9000) CEN (Comitato Europeo di Normazione – Ente Europeo di Normazione)  ha recepito le norme ISO come EN ISO 9000. In ITALIA UNI (Ente Italiano di Normazione) le ha recepite come UNI EN ISO 9000

ISO 9308-1 Escherichia coli

Pr EN 12780 Pseudomonas aeruginosa

ISO 6222 Carica Totale 22°C e 36°C

ISO 7899 Ricerca e conteggio di Enterococchi intestinali

Confronto con un metodo validazione di metodi biologici alternativi produttività Definizione del campo di applicazione selettività Confronto con un metodo di riferimento riproducibilità

FASE SPERIMENTALE decisione Allestimento colture batteriche miste con germi interferenti Diluizione della coltura di partenza fino a concentrazioni leggibili Analisi con il metodo di riferimento Analisi con il metodo di prova FASE SPERIMENTALE lettura lettura Conferma biochimica Conferma biochimica Calcolo della sensibilità e della specificità Calcolo della sensibilità e della specificità Verifica delle differenze di recupero mediante analisi della regressione lineare decisione Confronto della specificità e sensibilità mediante il test 2

Fase applicazione in doppio Il nuovo protocollo viene applicato a campioni sottoposti ad analisi routinarie accanto al metodo tradizionale, con conseguente verifica dei risultati. sostituzione Il metodo di riferimento viene sostituito con quello alternativo qualora i risultati ne comprovino la superiorità o l’equivalenza. Tutta la documentazione viene archiviata.

Controllo microbiologico dell’aria e delle superfici degli ambienti di lavorazione Campionatore d’aria Piastre da contatto

I microrganismi gram + (cocchi e bastoncelli) più interessanti per la microbiologia degli alimenti fanno parte delle seguenti famiglie e generi: Cocchi: fam. Micrococcaceae Gen. Streptococcus Gen. Pediococcus Gen. Leuconostoc Gen. Bacillus Gen. Clostridium Gen. Lactobacillus Gen. Listeria Gen. Erysipelotrix Gen. Brochotrix Gen. Micrococcus Gen. Staphylococcus Bastoncelli Gram + sporigeni Bastoncelli Gram + regolari non sporigeni Bastoncelli Gram + irregolari non sporigeni Gen. Corynebacterium Gen. Arthrobacter Gen. Brevibacterium Gen. Microbacterium Gen. Propionibacterium Gen. Bifidobacterium Bastoncelli Gram + irregolari non sporigeni Fam. Micobacteriaceae Gen. Mycobacterium

I microrganismi gram – di maggior interesse alimentare sono inclusi nelle seguenti famiglie: Fam. Pseudomodaceae Gen. Pseudomonas Gen. Xantomonas Gen. Acetobacter Gen. Gluconobacter Gen. Flavobacterium Gen. Alteromonas Gen. Alcaligenes Gen. Brucella Gen. Chromobacterium Fam. Neisseriaceae Gen. Moraxella Gen. Acinetobacter Fam. Vibrionaceae Gen. Aeromonas Gen. Vibrio Fam. Spirillaceae Gen. Campylobacter Poiché fermentano il lattosio vengono chiamati coliformi Fam. Enterobacteriaceae Gen. Escherichia Gen. Enterobacter Gen. Hafnia Gen. Citrobacter Gen. Klebsiella Gen. Erwinia Gen. Serratia Gen. Edwarsiella Non fermentano il lattosio Gen. Salmonella Gen. Shigella Gen. Proteus Gen. Providencia Gen. Yersinia

Batteri vs Alimenti Lamponi del Guatemala  Cyclospora cayetanensis Uova – latte – gelati  Salmonella tiphimurium Uova di pollo  Salmonella enteritidis Uova cotte all’ostrica  Salmonella enteritidis Hamburgers  Escherichia coli 0157:H7 Pollame – latte – acqua  Campylobacter jejuni Fragole  Epatite A Latte di cocco della Thailandia  Vibrio colerae

Coliformi totali Gruppo eterogeneo di cui fanno parte diversi gewneri quali: Arizona, citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella; in grado di fermentare il lattosio a 35 – 37°C. Non tutti i generi hanno habitat intestinale Coliformi termotolleranti Vi appartengono quei coliformi (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter) in grado di fermentare il lattosio a 44°C. Non tutti i generi hanno habitat intestinale Escherichia coli Specie in grado di fermentare il lattosio a 44°C e di produrre indolo in acqua peptonata. Habita intestinale. Enterococchi Hanno habitat fondamentalmente intestinale ma possono moltiplicarsi al di fuori di questo ambiente, sono più resistenti ai trattamenti di bonifica degli alimenti. Importanti nel controllo delle acque particolarmente quelle destinate alla molluschicoltura. Clostridi solfito-riduttori Germi sporigeni le cui spore possono ritrovarsi anche nell’ambiente esterno e sono resistenti ai trattamenti in grado di distruggere la maggior parte dei patogeni.

PARAMETRI MICROBIOLOGICI Escherichia coli Bacillo Gram (-) asporigeno appartenente alle Enterobacteriacee. Fa parte della normale fora intestinale. Alcune specie possono essere patogene per la produzione di tossine. È considerato indicatore di contaminazione fecale.

PARAMETRI MICROBIOLOGICI Streptococchi fecali Cocchi Gram (+) con tendenza a disporsi a catena; aerobi anaerobi facoltativi del genere Enterococcus. Si trovano nel tratto gastrointestinale di animali a sangue caldo. Sono considerati indicatori di contaminazione.

PARAMETRI MICROBIOLOGICI Conta totale a 37°C Tutti i batteri in grado di svilupparsi a 37°C. Sono importanti in quanto appartengono per lo più a germi della flora fecale umana o animale.

coliformi fecali bastoncelli Gram (-) aerobi oanaerobi facoltativi, appartengono alla famiglia delle Enterobacteriacee. Batteri lattosio fermentanti con produzione di gas. Presenti nel materiale fecale di origine umana (108 UFC/g). Sono considerati indicatori di contaminazione in atto. Devono risultare assenti in 100 ml di acqua

Coliformi totali bastoncelli Gram (-) aerobi o anaerobi facoltativi, appartengono alla famiglia delle Enterobacteriacee. Batteri lattosio fermentanti con produzione di gas. Presenti nel materiale fecale di origine umana (109 UFC/g), colonizzano il suolo,aria acqua, vegetazione. Sono considerati indicatori di contaminazione in atto. Devono risultare assenti in 100 ml di acqua

Streptococchi fecali cocchi Gram (+) con tendenza a disporsi a catena aerobi anaerobi facoltativi del genere Enterococcus. Si trovano nel tratto gastrointestinale di animali a sangue caldo. Devono risultare assenti in 100 ml di acqua Gli streptococchi fecali si moltiplicano raramente nelle acque inquinate e sono più persistenti di E. coli e dei batteri coliformi. Il loro valore primario per l’esame della qualità dell’acqua è perciò quello di indicatori aggiuntivi. Inoltre gli streptococchi sono altamente resistenti all’essiccamento e possono essere utili per il rilevare la contaminazione di acque sotterranee o superficiali causata dal dilavamento del suolo.

Clostridi solfito riduttori Sono organismi anaerobi e sporigeni, il più caratteristico dei quali C. perfrigens è normalmemte presente nelle feci, sebbene in numeri molto minori di E. coli. Tuttavia i clostridi non hanno esclusivamente una origine fecale e possono derivare da altre fonti ambientali. Le spore dei clostridi possono sopravvivere in acqua molto più a lungo degli organismi del gruppo dei coliformi e inoltre resistono alla disinfezione. a causa della loro longevità, trovano il loro impiego migliore come indicatori di contaminazione intermittente o remota. Poiché tendo a sopravvivere e ad accumularsi, possono essere rilevabili per lungo tempo dopo la contaminazione e in punti distanti dalla fonte contaminante.

Escherichia coli E’ un’ospite normale dell’organismo umano di cui rappresenta la specie predominante nella popolazione batterica residente nell’intestino. Si ritrova nelle acque di scarico, negli effluenti trattati e nei suoli sottoposti a contaminazioni fecali recenti, dovuti all’uomo, agli animali da allevamento e selvatici, agli uccelli. La sua presenza nell’acqua può essere considerata indizio sicuro di contaminazione fecale. E’ l’agente eziologico più frequente ed importante di infezioni delle vie urinarie e alcuni stipiti sono agenti eziologici di enteriti